[发明专利]一种比活提高的泛酸合成酶突变体及其应用

说明书

本发明属于酶工程技术领域，公开了一种催化能力提高的泛酸合成酶突变体及其应用，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。与谷氨酸棒杆菌来源的野生型泛酸合成酶相比，本发明所得的泛酸合成酶突变体S31K酶活提高了70%。

技术领域

本发明涉及一种比活提高的泛酸合成酶突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

泛酸又称维生素B5，是水溶性维生素B族的一种，具有旋光性，仅D型有生物活性。D-泛酸作为细胞中辅酶A合成的关键前体，参与人体和动物碳水化合物、脂肪和蛋白质等代谢反应，是维持正常生理机能不可缺少的微量物质。微生物和植物可以合成D-泛酸，但人类和其他动物不能合成，因此D-泛酸被广泛应用于医药、化妆品、食品和饲料行业等。临床上用于治疗维生素B缺乏症、周围神经炎、手术后肠梗阻﹑链霉素中毒及类风湿等疾病。D-泛酸在酸、碱、光和热条件下都不稳定，一般以钙盐形式（D-泛酸钙）进行储藏、运输和商品交易。

泛酸合成酶(pantothenate synthetase,PS)(EC 6.3.2.1)是panC基因的表达产物，是以同型二聚体形式存在的。它是泛酸生物合成途径的最后一个关键酶，催化泛解酸与β-丙氨酸在ATP依赖性反应中结合形成D-泛酸。SDS-PAGE凝胶电泳法测得亚基的分子量约为33 kDa。其酶反应动力学机制为“Bi Uni Uni Bi Ping Pong”，在该机制中，它首先在有Mg²⁺的环境下与ATP结合，然后与泛解酸结合，形成反应中间体泛酰腺苷酸，随后释放出焦磷酸盐，为β-丙氨酸的结合和反应腾出了空间，最终产生了两种产物泛酸和AMP。

目前，生产D-泛酸的方法有：①物理诱导结晶法，利用混旋泛酸钙的溶解度大于D-型或L-型这一特点进行诱导结晶，此方法工艺成熟，但只能生产泛酸钙，无法用于其他泛酸衍生物的生产。②化学拆分法，利用氯酶胺等手性拆分剂拆分，但拆分剂价格昂贵，分离困难，还存在毒性和环境污染问题。③微生物法，包含代谢工程法、发酵法和生物酶法，Zhang等利用代谢工程法生产D-泛酸，方法复杂，产量低，最高产量仅28 .45g/L；发酵法的产量较高，但存在发酵产物成分复杂，不利于下游提取等问题，发酵过程中产生的物质对食品品质也会产生一定影响；生物酶法是利用泛酸合成酶(PS)催化D-泛解酸和β-丙氨酸进行缩合反应生成D-泛酸，反应条件温和，没有副产物的生成，更有利于产品分离。

泛酸合成酶生产D-泛酸最重要的酶，但很少有研究集中在泛酸合成酶上。因此，有必要获得一种催化能力提高的泛酸合成酶突变体筛选泛酸合成酶，并将其在宿主细胞中进行优化表达，来提高泛酸的产量，促进D-泛酸产业的顺利发展，具有重大的经济和社会价值。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的第一目的是提供了一种比活提高的泛酸合成酶突变体，所述泛酸合成酶突变体含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述泛酸合成酶突变体是以氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的泛酸合成酶为亲本酶，将第31位的丝氨酸突变为赖氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述亲本酶来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)引用自文献：Tigu, F.,et al. (2018). A highly active pantothenate synthetase from Corynebacteriumglutamicum enables the production of D-pantothenic acid with highproductivity. Appl Microbiol Biotechnol 102(14): 6039-6046.。

本发明的第二目的是提供一种编码上述比活提高的泛酸合成酶突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .4。