[发明专利]用于检测碱性磷酸酶的单分子荧光生物传感器及其方法

说明书

本发明涉及一种用于检测碱性磷酸酶的单分子荧光生物传感器及其方法。本发明构建了一种新型的单分子荧光生物传感器用于ALP检测，可准确、灵敏地监测细胞和血清样品中的碱性磷酸酶水平。该生物传感器的信号扩增和转导通过无酶组装和拆卸过程实现，大大简化了检测方案，降低了检测成本，减少了非特异性信号。结合单分子检测技术，ALP活性可在单分子水平超灵敏准确检测，检出限为2.61×10^‑6U/mL。

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种ALP超灵敏单分子荧光生 物传感器。

背景技术

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的荧光测定法通常需要复杂 和昂贵的程序来合成荧光纳米材料或小分子荧光探针。此外，非核酸分子如酚 酞磷酸、对苯二酚二磷酸、多肽、对硝基苯基磷酸(PNPP)、焦磷酸、鸟嘌呤 一磷酸、三磷酸腺苷等常被用作ALP的底物，但它们不像DNA或RNA一样容易 扩增，因此，这些检测方法的灵敏度较低，无法准确检测罕见样品中低丰度的 ALP靶点。为了解决这一问题，已发展了多种核酸信号扩增的方法用于ALP的 检测，但需要多种特异性酶触发扩增系统，如DNA连接酶介导的连接酶扩增反应，DNA、RNA聚合酶和Cas13a核酸酶介导RNA转录偶联环状切割反应，RNA 聚合酶和双特异性核酸酶介导的RNA转录诱导双信号放大，以及DNA聚合酶和 内切酶介导的指数信号放大，然而上述方法势必会增加实验成本，使反应过程 复杂化。此外，酶活性的不稳定性和非特异性扩增也会极大地影响分析的准确 性和重现性。

因此，非常需要开发一种操作简单，经济有效，特异性强和超灵敏的ALP 的测定方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明构建了一种新型的单分子荧光生物传感器用 于ALP检测，可准确、灵敏地监测细胞和血清样品中的碱性磷酸酶水平。该生物 传感器中涉及的所有探针都是商业可用的，避免了制备功能性荧光纳米材料或 小分子荧光探针的昂贵和费力的步骤。该生物传感器的信号扩增和转导通过无 酶组装和拆卸过程实现，大大简化了检测方案，降低了检测成本，减少了非特 异性信号。结合单分子检测技术，ALP活性可在单分子水平超灵敏准确检测，检 出限为2.61×10^-6U/mL。

一种用于检测碱性磷酸酶的单分子荧光生物传感器，其包括：在3'端标记 生物素的5'磷酸化的单链DNA、发夹探针1(HP1)、发夹探针2(HP2)、 链霉亲和素偶联磁珠、氢氧化钠溶液；其中，发夹探针1(HP1)和发夹探针 2(HP2)为Cy5标记的发夹探针1(HP1)和发夹探针2(HP2)；单链DNA 和发夹探针1(HP1)和发夹探针2(HP2)通过链置换反应形成探针·HP1·HP2 三重链。

所述单链DNA从5'端到3'端的序列为：P-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA TTTTTT-Biotin；

发夹探针1(HP1)从5'端到3'端的序列为：TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACTCAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-Cy5；

发夹探针2(HP2)从5'端到3'端的序列为：AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAACAC GCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG-Cy5。

进一步的，所述氢氧化钠溶液浓度为1.5-2mol/L，优选1mol/L。

进一步的，单分子荧光生物传感器包括λexo酶。

一种利用单分子荧光生物传感器的碱性磷酸酶检测方法，包括如下步骤：