[发明专利]用于检测碱性磷酸酶的单分子荧光生物传感器及其方法在审
| 申请号： | 202111492541.7 | 申请日： | 2021-12-08 |
| 公开（公告）号： | CN114517225A | 公开（公告）日： | 2022-05-20 |
| 发明（设计）人： | 张春阳;马飞;赵宁宁 | 申请（专利权）人： | 山东师范大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6825 | 分类号： | C12Q1/6825;C12Q1/42 |
| 代理公司： | 济南圣达知识产权代理有限公司 37221 | 代理人： | 张晓鹏 |
| 地址： | 250014 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 用于 检测 碱性磷酸酶 分子 荧光 生物 传感器 及其 方法 | ||
1.一种用于检测碱性磷酸酶的单分子荧光生物传感器，其特征在于，所述单分子荧光生物传感器包括：单链DNA、发夹探针1(HP1)、发夹探针2(HP2)、链霉亲和素偶联磁珠、氢氧化钠溶液；其中，单链DNA为在3'端标记生物素的5'磷酸化的单链DNA；发夹探针1(HP1)和发夹探针2(HP2)为Cy5标记的发夹探针；单链DNA和发夹探针1(HP1)和发夹探针2(HP2)通过链置换反应形成探针·HP1·HP2三重链。
2.根据权利要求1所述的单分子荧光生物传感器，其特征在于，所述单链DNA从5'端到3'端的序列为：P-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA TTT TTT-Biotin。
3.根据权利要求1所述的单分子荧光生物传感器，其特征在于，发夹探针1(HP1)从5'端到3'端的序列为：TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGCGTG-Cy5；
发夹探针2(HP2)从5'端到3'端的序列为：AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CACGCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG-Cy5。
4.根据权利要求1所述的单分子荧光生物传感器，其特征在于，所述氢氧化钠溶液浓度为1.5-2mol/L，优选1mol/L；单分子荧光生物传感器包括λexo酶。
5.一种利用如上述权利要求任一项所述的单分子荧光生物传感器的碱性磷酸酶检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将含碱性磷酸酶的待测物、在3'端标记生物素的5'磷酸化的单链DNA和缓冲液混合，在适当温度下进行孵育；(2)然后加入λexo酶在适当温度下反应；(3)将反应得到的消化产物加入到含有杂交缓冲液、HP1和HP2的溶液中，在适当温度下反应；(4)随后加入链霉亲和素偶联磁珠捕获杂交产物，并通过磁分离去除未反应的HP1和HP2；(5)用反应缓冲液洗涤后，加入NaOH溶液孵育，诱导DNA链解体，得到含有游离HP1和HP2的上清液，用于进一步测定。
6.根据权利要求5所述的碱性磷酸酶检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在3'端标记生物素的5'磷酸化的单链DNA的浓度为200-300纳摩尔每升，优选250纳摩尔每升；缓冲液为10×CutSmart缓冲液；在37℃下孵育30-50分钟，优选40分钟。
7.根据权利要求5所述的碱性磷酸酶检测方法，其特征在于，步骤(2)中，λexo酶的用量为3-5U，优选4U；在37℃下反应20-40分钟，优选30分钟。
8.根据权利要求5所述的碱性磷酸酶检测方法，其特征在于，步骤(3)中，杂交缓冲液由50毫摩尔每升Na2HPO4和0.5摩尔每升NaCl组成，其pH为6.8；HP1和HP2浓度为400纳摩尔每升；在37℃下反应0.5-2小时，优选1小时。
9.根据权利要求5所述的碱性磷酸酶检测方法，其特征在于，步骤(4)中，链霉亲和素包覆的磁珠的用量为4-6微升，优选5微升。
10.根据权利要求5所述的碱性磷酸酶检测方法，其特征在于，步骤(5)中，加入含1摩尔每升NaOH的蒸馏水50微升，反应5分钟，诱导DNA链解体。
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