[发明专利]一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法，属于生物检测领域。其中提供的检测尖音库蚊的环介导等温扩增引物包括基于尖音库蚊的COI基因序列设计的四条或五条特异性LAMP引物，能够实现对尖音库蚊的高灵敏度和高特异性检测。本发明还提供用于检测尖音库蚊的环介导等温扩增试剂盒和检测方法。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法。

背景技术

尖音库蚊(Culex pipiens)是蚊科的吸血蚊子，通常是指包含尖音库蚊指名亚种、致倦库蚊亚种、淡色库蚊亚种和骚扰库蚊亚种的复合组，分布广泛，是全球传播疾病的重要媒介，能够引起人类疾病，例如由尖音库蚊作为主要传播媒介引起的班氏丝虫病。因此对尖音库蚊进行鉴别有助于防止尖音库蚊虫媒疾病的传播和扩散。

目前，对尖音库蚊的研究重要集中在基于基因测序的分子分类系统学上，对该蚊虫的鉴别方法也主要集中在通过医学媒介生物的传统形态鉴定，其存在很多问题，例如受发育状态、肢体残缺不全的限制以及近缘种影响等难以准确鉴定，另外还存在鉴定周期长、鉴定人员技术水平要求高、费时费力等缺陷。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增引物，其包括：

包含如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列的正向内引物FIP，

包含如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列的反向内引物BIP，

包含如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的正向外引物F3，和

包含如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列的反向外引物B3。

上述环介导等温扩增引物还包括包含如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列的反向环引物LB。

本发明的另一方面还提供一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增试剂盒，其包括上述的环介导等温扩增引物。

上述环介导等温扩增试剂盒还包括用于环介导等温扩增检测尖音库蚊的反应体系的反应缓冲液、荧光染料、DNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺。

上述环介导等温扩增试剂盒还包括用于环介导等温扩增检测尖音库蚊的反应体系的Bst4.0 SYBR Green IsoAmp MasterMix，其包含反应缓冲液、SYBR Green荧光染料、Bst 4.0DNA/RNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺。

本发明再一方面还提供一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增方法，其包括以下步骤：

1)提取待测样品DNA；

2)利用上述的环介导等温扩增试剂盒对步骤1)提取的待测样品DNA进行环介导等温扩增，读取扩增曲线；

3)根据步骤2)读取的扩增曲线结果进行判定：

若阳性对照出现扩增曲线，且阴性对照不出现扩增曲线，则证明试验结果有效；

若待测样品的环介导等温扩增反应体系出现扩增曲线，则为阳性，表明在待测样品中含有尖音库蚊；若待测样品的环介导等温扩增反应体系不出现扩增曲线，则为阴性，表明在待测样品中不含尖音库蚊。

上述方法中，在步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的20μl反应体系包含：2xBst4.0 SYBR Green IsoAmp MasterMix 8-12μl，作为模板的待测样品DNA 1-3μl，正向内引物FIP和反向内引物BIP的浓度分别为15-17μM、正向外引物F3和反向外引物B3的浓度分别为1-3μM，ddH₂O补充至体积为20μl。