[发明专利]一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法

权利要求书

1.一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增引物，其包括：

包含如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列的正向内引物FIP，

包含如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列的反向内引物BIP，

包含如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的正向外引物F3，和

包含如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列的反向外引物B3。

2.根据权利要求1所述的环介导等温扩增引物，其还包括：

包含如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列的反向环引物LB。

3.一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增试剂盒，其包括权利要求1或2所述的环介导等温扩增引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其还包括用于环介导等温扩增检测尖音库蚊的反应体系的反应缓冲液、荧光染料、DNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其还包括用于环介导等温扩增检测尖音库蚊的反应体系的Bst4.0 SYBR Green IsoAmp MasterMix，其包含反应缓冲液、SYBR Green荧光染料、Bst 4.0 DNA/RNA聚合酶、dNTP和Mg²⁺。

6.一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增方法，其包括以下步骤：

1)提取待测样品DNA；

2)利用权利要求3-5中任一项所述的环介导等温扩增试剂盒对步骤1)提取的待测样品DNA进行环介导等温扩增，读取扩增曲线；

3)根据步骤2)读取的扩增曲线结果进行判定：

若阳性对照出现扩增曲线，且阴性对照不出现扩增曲线，则证明试验结果有效；

若待测样品的环介导等温扩增反应体系出现扩增曲线，则为阳性，表明在待测样品中含有尖音库蚊；若待测样品的环介导等温扩增反应体系不出现扩增曲线，则为阴性，表明在待测样品中不含尖音库蚊。

7.根据权利要求6所述的方法，其中在步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的20μl反应体系包含：2xBst4.0 SYBR Green IsoAmp MasterMix 8-12μl，作为模板的待测样品DNA 1-3μl，正向内引物FIP和反向内引物BIP的浓度分别为15-17μM、正向外引物F3和反向外引物B3的浓度分别为1-3μM，ddH₂O补充至体积为20μl。

8.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的20μl反应体系还包含反向环引物LB，其浓度为3-5μM。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的反应条件为：反应温度为60-66.4℃，反应时间为18-40min。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其中步骤2)中对待测样品DNA进行环介导等温扩增的反应条件为：反应温度为63-65℃，反应时间为18-20min。