[发明专利]一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法

说明书

本发明公开了一种基于固相富集结合O‑糖肽酶切分析Tn抗原的方法，包括步骤：蛋白提取和浓度测量；蛋白酶解；多肽纯化；固相结合；唾液酸处理；N聚糖切除；OpeRATOR酶切；O‑Glycoprotease酶切；LC‑MS分析。该方法能够在固相上耦合糖肽，使用两种O‑糖肽酶切O‑糖肽来鉴定Tn抗原的O‑糖基化位点和Tn抗原的表达量，用作癌症诊断的生物标志物。

技术领域

本发明属于生物分子分析试剂技术领域，具体涉及固相偶联糖肽和采用O-糖肽酶切富集Tn抗原的分析方法。

背景技术

Tn抗原(O-GalNAc)是一种与肿瘤相关的碳水化合物，在大多数癌组织表面高表达。它的分子量小、结构简单、通常表达在细胞表面，可被免疫系统识别为外来物。因此，检测Tn抗原的表达不仅反映免疫抑制微环境的情况，并且可作为癌症的诊断标志物-特别是早期阶段的特征，也可显示肿瘤的进展以及预后状况。目前对于Tn抗原的检测手段主要有单克隆抗体、凝集素富集以及点击化学等。这些方法大多缺乏特异性和灵敏度，易造成结果的假阳性和假阴性率，且步骤繁琐、成本高。点击化学的催化效率低且重现性差。无铜点击化学生物素方法，所用试剂较为昂贵且叠氮化物剧毒、易爆炸。目前缺乏一种高效便捷的方法能够检测Tn抗原的表达及鉴定其在标志物中的特异性位点。

因此，有必要研发一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法来解决现有技术中鉴定Tn抗原糖蛋白标志物的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法。

本发明的一种技术方案是：

一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法，包括步骤：

1)蛋白提取和浓度测量；

2)蛋白酶解；

3)多肽纯化；

4)固相结合；

5)唾液酸处理；

6)N聚糖切除；

7)OpeRATOR酶切；

8)O-Glycoprotease酶切；

9)LC-MS分析。

进一步的，在步骤1)中，所述蛋白提取和浓度测量包括：在细胞中依次加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和EDTA后，使用超声破碎仪破碎，冷却，重复操作直至样本溶液澄清，离心，取上层清液并用1×Tris稀释，使用Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒测试蛋白的浓度。

进一步的，在步骤2)中，所述蛋白酶解包括步骤：

(1)根据测定的蛋白的浓度，从上层清液中取蛋白，使得所述蛋白的总量在400-600ug，溶于尿素，轻微振荡，直至蛋白完全溶解，获得样品溶液；

(2)向所述样品溶液中加入总体积1/10的TCEP，孵育；

(3)向所述样品溶液中加入总体积1/10的IAA，置于暗箱中孵育；

(4)向所述样品溶液中加入HPLC水，使得所述样品溶液中尿素的浓度＜1.6M，调节所述样品溶液的pH至7-9；

(5)向所述样品溶液中加入胰蛋白酶，使得所述样品溶液的蛋白量与所述胰蛋白酶的体积比为50:1～40:1，孵育过夜。

进一步的，在步骤3)中，所述多肽纯化包括步骤：

(1)向所述样品溶液中加入甲酸，使所述样品溶液的pH＜3；

(2)将所述样品溶液加入预先处理的C18萃取柱中，重复操作；