[发明专利]一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法

权利要求书

1.一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法，其特征在于，包括步骤：

1)蛋白提取和浓度测量；

2)蛋白酶解；

3)多肽纯化；

4)固相结合；

5)唾液酸处理；

6)N聚糖切除；

7)OpeRATOR酶切；

8)O-Glycoprotease酶切；

9)LC-MS分析。

2.根据权利要求1所述的一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述蛋白提取和浓度测量包括：在细胞中依次加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和EDTA后，使用超声破碎仪破碎，冷却，重复操作直至样本溶液澄清，离心，取上层清液并用1×Tris稀释，使用Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒测试蛋白的浓度。

3.根据权利要求2所述的一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述蛋白酶解包括步骤：

(1)根据测定的蛋白的浓度，从上层清液中取蛋白，使得所述蛋白的总量在400-600ug，溶于尿素，轻微振荡，直至蛋白完全溶解，获得样品溶液；

(2)向所述样品溶液中加入总体积1/10的TCEP，孵育；

(3)向所述样品溶液中加入总体积1/10的IAA，置于暗箱中孵育；

(4)向所述样品溶液中加入HPLC水，使得所述样品溶液中尿素的浓度＜1.6M，调节所述样品溶液的pH至7-9；

(5)向所述样品溶液中加入胰蛋白酶，使得所述样品溶液的蛋白量与所述胰蛋白酶的体积比为50:1～40:1，孵育过夜。

4.根据权利要求3所述的一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述多肽纯化包括步骤：

(1)向所述样品溶液中加入甲酸，使所述样品溶液的pH＜3；

(2)将所述样品溶液加入预先处理的C18萃取柱中，重复操作；

(3)使用0.1％TFA多次清洗萃取柱；

(4)使用50％ACN+0.1％TFA洗脱C18萃取柱中的多肽并收集洗脱液，重复操作；

(5)将多次多肽的洗脱液合并真空冷冻干燥获得多肽样品。

5.根据权利要求4所述的一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述固相结合包括步骤：

(1)配置缓冲液体系，测试pH 10-11，将所述缓冲液体系稀释；

(2)取表面具有醛基的球状树脂的固相，加入所述缓冲液体系预处理，去掉过滤液，重复操作两次；

(3)将所述多肽样品重新溶于去离子水中，涡旋振荡，并加入具有缓冲液体系的固相中，涡旋，并孵育、离心去除溶液，获得固相样品；

(4)向所述固相样品中加入NaCNBH₃，涡旋，孵育后离心去除溶液；

(5)使用PBS涡旋离心去除溶液，清洗；

(6)向所述固相样品中加入PBS和NaCNBH₃，孵育，涡旋离心去除溶液；

(7)使用Tris-HCl清洗所述固相样品，再加入NaCNBH₃和1×Tris，孵育，分别使用NaCl和去离子水清洗所述固相样品。

6.根据权利要求5所述的一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法，其特征在于，在步骤5)中，所述唾液酸处理包括：向所述固相样品中加入1×PBS，并用1％TFA调节pH为5.5，再加入神经氨酸苷酶，孵育，涡旋，离心去除溶液，并用10％ACN+0.1％TFA洗脱所述固相样品。