[发明专利]一种浆母细胞与胰岛免疫损伤相关性的评估方法

说明书

本发明公开了一种浆母细胞与胰岛免疫损伤相关性的评估方法，包括分离组织样本、流式细胞分析及分选浆母细胞、细胞共培养和/或细胞过继转移、建立胰岛炎评估标准等。本发明的评估方法可有效的建立浆母细胞与胰岛免疫损伤相关性，为1型糖尿病的免疫损伤的早期诊断提供了可能性。

技术领域

本发明属于生物和医药技术领域，具体涉及一种浆母细胞与胰岛免疫损伤相关性的评估方法。

背景技术

1型糖尿病是胰岛β细胞特异性免疫损伤而导致胰岛素绝对缺乏的自身免疫性疾病。患者一旦确诊须尽早起始外源性胰岛素治疗，以减轻胰岛β细胞的代谢负荷，降低糖尿病酮症或酮酸症中毒发生风险。明确糖尿病分型诊断、早期识别1型糖尿病对制定治疗方案至关重要。目前，1型糖尿病尚缺乏明确的诊断标准，主要根据临床表现进行判断，辅助诊断的实验室指标少，主要参考胰岛自身抗体、血清胰岛素或C肽测定。然而，1型糖尿病人群的临床特征呈现异质性，在发病年龄、起病特点、胰岛功能状态、胰岛自身抗体类型等存在较大差异，部分患者的诊断往往是一种回顾性诊断，在起病初期确诊有时非常困难。

现有辅助临床诊断的检测指标仅有胰岛自身抗体与胰岛功能测定，亟待探寻能有效反应胰岛自身免疫损伤的新方法。目前，已发现一种参与1型糖尿病的胰岛免疫损伤的B淋巴细胞亚型，但对浆母细胞与胰岛免疫损伤的相关性并不了解，无法评估浆母细胞对1型糖尿病的胰岛免疫损伤的作用。

发明内容

有鉴于此，本发明期望提供一种浆母细胞与胰岛免疫损伤相关性的评估方法，能够辅助探寻浆母细胞与胰岛免疫损伤的相关性，对浆母细胞在1型糖尿病的胰岛免疫损伤的作用进行准确的评估。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种浆母细胞与胰岛免疫损伤相关性的评估方法，包括以下步骤：

1)分离不同阶段1型糖尿病病人或NOD模型动物胰腺淋巴结组织和脾脏中的免疫细胞；优选地，不同阶段的所述NOD模型动物为饲养至4周、8周、12周、16周、20周、24周的NOD模型动物；优选地，所述NOD模型动物为NOD小鼠；

2)免疫细胞分析，分选浆母细胞，构建浆母细胞含量与1型糖尿病病人或NOD模型动物不同阶段的关系，为正相关；

3)将浆母细胞或浆母细胞与T淋巴细胞的组合，进行过继转移，监测发生糖尿病的速度和比例，以及胰岛炎情况；

和/或，将T淋巴细胞、浆母细胞与胰岛共培养，检测胰岛凋亡情况；

4)建立胰岛炎评估标准，并根据胰岛中免疫细胞浸润程度进行胰岛炎评分。

本发明还提供胰岛炎评分标准：0分，完整胰岛，无免疫细胞浸润；1分，仅在胰岛周围有免疫细胞浸润，或胰岛内免疫细胞浸润面积小于25％；2分，胰岛内免疫细胞浸润面积达25％-50％；3分，胰岛内免疫细胞浸润面积达50％-75％；4分，胰岛内免疫细胞浸润面积超过75％。

所述步骤1)中包括分离胰腺淋巴结和脾脏，研磨得细胞悬液，胰腺淋巴结细胞悬液离心后得到胰腺淋巴结免疫细胞；脾脏细胞沉淀中加入红细胞裂解液，裂解后离心得到脾脏免疫细胞。

所述步骤2)中包括将步骤1)的免疫细胞转移至流式管，加入流式抗体预混孵育，再加入细胞死活染料孵育，经Stain buffer洗涤重悬后，使用流式细胞仪分选所需的T淋巴细胞和浆母细胞。

所述步骤3)中包括将T淋巴细胞与浆母细胞共同转移至NOD/SCID小鼠，监测随机血糖，取得胰腺组织，切片，进行HE染色及免疫组化染色，采集图片。

所述步骤3)中T淋巴细胞与浆母细胞的比例为1～10:10～1，优选为20:2～5或2:1。

所述步骤3)中检测胰岛凋亡的方法为TUNEL法。