[发明专利]一种利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法

说明书

本发明公开了一种利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法，是制备利用纤维素诱导型启动子Pegl2过表达转录调控因子xyr1基因的表达盒，将其转化到里氏木霉QEB4菌株中得到高纤维素水解酶活里氏木霉工程菌株QE2X，并利用该工程菌株发酵制备高活性的纤维素水解酶。实验证实利用本发明方法生产的纤维素水解酶活性为34.9IU/mg，显著高于出发菌株QEB4(10IU/mg)，酶系各组分均大幅提升，并且β‑葡萄糖苷酶的酶活为92.4IU/mg，为出发菌株的2.83倍。本发明具有良好的工业开发和应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法和其专用工程菌株。

背景技术

木质纤维素生物质作为地球上的可再生资源之一，其主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，资源丰富。木质纤维素分解酶水解生物质是将生物质转化为可发酵糖以生产生物燃料的有效方法。但是，在实际应用中纤维素水解酶较高的生产成本极大地影响了最终产品的价格和竞争力。为了解决该问题，亟需提升产纤维素水解酶菌株的生产能力。

目前用来提升纤维素水解酶产量的方法主要有：发酵工艺优化、菌株诱变，以及利用基因工程技术构建工程菌株等；其中通过基因工程技术优化酶系组分是提升纤维素水解酶产量的最常用的方法之一。然而根据现有的文献记载，在提升酶活方面，操纵主要纤维素水解酶基因的表达远不如改造纤维素酶转录调控因子有效。同时影响纤维素水解酶生产成本的另一个因素是酶系中β-葡萄糖苷酶的不足，β-葡萄糖苷酶的缺乏导致纤维素水解过程中纤维二糖的积累，这会抑制外切纤维素酶的活性，进而导致整个酶系效率的降低。

丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)由于其强大的分泌纤维素水解酶的能力而被认为是生产生物燃料的主要细胞工厂，其存在一个强大且复杂的转录调控网络，控制着纤维素水解酶基因的表达。到目前为止，已经发现了至少四个转录激活因子(Xyr1、Ace2、Ace3和Hap2/3/5复合体)以及三种转录抑制因子(Ace1、Cre1、Rce1)，这些转录因子在纤维素水解酶的生物合成中发挥重要功能。通过对里氏木霉纤维素水解酶基因表达的转录调控网络进行改造，有望能够降低生物酶制剂的成本；然而实验发现通过改造转录调控因子提升纤维素水解酶活的方法即便有效，但是对β-葡萄糖苷酶的提升作用不明显。经检索，在提升纤维素水解酶产量实际的应用中对于包括Xyr1在内的转录因子改造的文献或成熟的技术方案以及具体的利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法和其专用工程菌株还鲜见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法和其专用工程菌株。

本发明所述的利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法，步骤是：

(1)以里氏木霉QEB4基因组为模板，利用引物对Egl2-F/Egl2-R扩增含有纤维素诱导型启动子的核苷酸序列，该启动子命名为Pegl2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；以里氏木霉QEB4基因组为模板扩增xyr1基因及其终止子区域，利用引物对Hph-UF/Hph-UR、Hph-DF/Hph-DR分别扩增hph基因的上下游同源臂，然后将其上游同源臂、抗性基因prtA、Pegl2、xyr1基因及其终止子、下游同源臂按顺序进行融合，制得表达盒，该表达盒命名为Pegl2-xyr1过表达盒；其中所述的ptrA抗性基因扩增于质粒T-ptrA，所述引物的核苷酸序列如下：

Egl2-F：AAACACCTCGCTCCAGTGC；

Egl2-R：TGTCGATGACGGGGAGATAT；

Hph-UF：GCTGTTCTCCAAGGCGTCA；

Hph-UR：AACAAAGATGCAAGAGCGGGGAGCCGAGAGGGTAGTAATG；