[发明专利]一种碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法及应用

权利要求书

1.一种非诊断目的的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法，其特征在于，包括：

1)使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺进行水热反应，制得碳荧光微球；

2)在所述碳荧光微球的表面修饰羧基；

3)将待分析物对应的抗体或适配体连接到步骤2)所获碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；

4)在层析膜上设有检测线和质控线，其中质控线固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述检测线固定有能与待分析物结合或与步骤3)所述抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体；

5)以样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫、底板和卡壳构建成荧光侧流层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和卡壳具有低荧光特性；

6)将步骤3)所获抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度﹐并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线实现待分析物的定量检测。

2.根据权利要求1所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法，其特征在于，步骤1)包括：使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺溶解于水中，并在80～220℃进行水热反应1～24h，制得碳荧光微球；优选的，所述碳荧光微球的粒径为3～200nm；优选的，所述结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺的摩尔比为1:0.1～1；

和/或，所述碳荧光微球的发射波长为500～700nm。

3.根据权利要求1所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤2)包括：采用丁二酸酐法在所述碳荧光微球的表面修饰羧基，反应为无水条件，溶剂包括DMF、二甲基亚砜、乙二醇、乙醇、丙三醇中的任意一种或两种以上的组合；和/或，步骤2)所获碳荧光微球的荧光发射波长为440～600nm。

4.根据权利要求1所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤3)包括：采用化学交联将待分析物对应的抗体或适配体连接到步骤2)所获碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；优选的，所述化学交联包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺活化偶联方法将待分析物对应的抗体或适配体与碳荧光微球进行反应，反应所选缓冲液包括2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，pH值为4.5～7.5；优选的，所述方法还包括：活化羧基后用碱性物质调节pH值至7.0。

5.根据权利要求4所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤3)中，所述待分析物对应的抗体或适配体包括抗原、半抗原、单克隆抗体、多克隆抗体或适配体；

优选的，所述抗体修饰的碳荧光微球中抗体包括抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，标记的能识别黄曲霉毒素B1的DNA链的序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求5所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤4)中，基于抗原-抗体的试纸条质控线为能与荧光标记抗体结合的抗体，而基于适配体的试纸条质控线为碳荧光微球荧光标记DNA的互补链；

优选的，基于抗原-抗体检测黄曲霉毒素B1的试纸条检测线固定有AFB1-BSA，质控线固定有山羊抗小鼠IgG；

优选的，基于适配体检测黄曲霉毒素B1的试纸条检测线固定有AFB1-BSA，质控线固定有与碳荧光微球荧光标记DNA链的互补链，具体序列如SEQ ID NO.2所示；

和/或，所述检测线与质控线的间隔距离为3mm～10mm。