[发明专利]一种桑干细胞的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种桑干细胞的制备方法及其应用，所述方法包括：利用桑树外植体放入到蔗糖高渗透液中处理，获得桑形成层组织，将所述桑形成层组织种植在固体培养基上，获得桑干细胞团，酶解所述桑干细胞团，分离形成单个桑干细胞，利用液体培养基传代培养、放大培养所述单个桑干细胞，获得桑干细胞培养物；其中，所述酶解采用纤维素酶和果胶酶。本发明桑干细胞的制备方法具有分化明显、增殖快并且培养周期短，制备的桑干细胞具有明显的抗氧化、抗衰老和降血糖活性，可以被广泛应用于药品、化妆品、营养与功能食品领域。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种桑干细胞的制备方法及应用。

背景技术

桑(拉丁名：Morus alba L.)是桑科，桑树属落叶乔木或灌木。桑树叶(简称桑叶)原产于中国、韩国及日本，迄今为止全球已有50％的国家种植。我国是最大的桑树种植国，桑叶是桑树的主要产物，占地上部分产量的64％之多，因此桑叶在我国具有极大的种质资源优势。桑树在历代《本草》中被称为神木，桑叶在《神农本草经》中称为神仙叶，其性寒、味甘苦，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目之功效。桑叶提取物含有丰富的多糖、黄酮(芦丁、槲皮素)和生物碱(1-脱氧野尻霉素，1-DNJ)等活性成分，其中一种重要标志性活性成分1-脱氧野尻霉素，1-DNJ是一种多羟基哌啶类小分子生物碱，化学名称为3,4,5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，1-DNJ目前发现主要存在于桑树植物和微生物中，桑树植物是唯一发现含有1-DNJ类结构化合物的植物。

近年来，人们已经证明1-DNJ具有良好的降血糖、抗病毒感染等生物活性。如今，大部分桑叶提取物厂家以1-DNJ含量作为质量检测的关键成分，1-DNJ含量水平是桑叶及其提取物的重要质量指标。2020年，桑叶总生物碱片作为降血糖药物上市。由于桑叶提取物具有提高免疫力、降血糖和抗氧化等功效，广泛应用于医药、保健食品、化妆品、饲料添加剂等领域，国内外以桑叶为原料的保健品年产值达到数十亿元。因此，桑叶提取物将具有更加广阔的市场空间和巨大经济价值。

然而，桑叶中活性成分1-DNJ含量偏低，通过桑叶种植、提取关键活性成分1-DNJ的生产周期长、成本高；另一方面，桑叶中总生物碱及DNJ含量同样会受品种、采集季节及种植基地等因素的影响,此外，以桑叶为原料制备提取物还需要控制农药残留，因此建立一种可靠、稳定的桑叶DNJ制备方法非常必要。

发明内容

为此，本发明提供一种桑干细胞的制备方法及应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明实施例提供一种桑干细胞的制备方法，所述方法包括：利用桑树外植体放入到蔗糖高渗透液中处理，获得桑形成层组织，将所述桑形成层组织种植在固体培养基上，获得桑干细胞团，酶解所述桑干细胞团，分离形成单个桑干细胞，利用液体培养基传代培养、放大培养所述单个桑干细胞，获得桑干细胞培养物；

其中，所述酶解采用纤维素酶和果胶酶。

本发明的一个实施例中，所述桑树外植体为叶片、芽尖、叶柄和茎段中的一种。

本发明的一个实施例中，所述桑形成层组织的培养条件为温度26±2℃，光照时间为12h，pH值5.5～6.0，培养10～20d。

本发明的一个实施例中，所述酶解中，纤维素酶的用量为质量分数为1％～3％，果胶酶的质量分数为0.1～0.5％，酶解的时间为1～3h。

本发明的一个实施例中，所述固体培养基的组成为：含有10～25g/L蔗糖、7.5g/L琼脂，0.1～0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.1～1.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和0.1～1.0mg/L萘乙酸的B5培养基。

本发明的一个实施例中，所述的液体培养基的组成为：含有0.2～1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、10～30mg/L的蔗糖、0.5～1.5mg/L的甲基茉莉酮酸酯和1.0～2.0mg/L的萘乙酸的B5培养基。