[发明专利]基于RT-RAA荧光方法检测乙型脑炎病毒的试剂和试剂盒

说明书

本发明公开了基于RT‑RAA荧光方法检测乙型脑炎病毒的试剂和试剂盒。所述试剂盒包括检测乙型脑炎病毒的组合物；所述组合物包括引物JEV‑RAA‑F2、JEV‑RAA‑R1和探针；所述引物JEV‑RAA‑F2的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述JEV‑RAA‑R1的核苷酸序列如序列3所示；所述探针的核苷酸序列如序列4所示。该试剂盒只需39℃条件下反应30min就可以准确检测出待测样本中是否含有乙型脑炎病毒，且具有很高的灵敏性和特异性，最低检测极限为5.5×10¹copies/μL的JEV阳性标准质粒转录本，可以应用于临床中乙型脑炎病毒的快速高效检测，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于荧光方法RT-RAA检测乙型脑炎病毒的试剂和试剂盒。

背景技术

乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的虫媒性的人畜均可感染的中枢神经系统的传染性疾病。该病往往会伴随出现一些神经系统表现的症状，比如高热、狂暴、精神沉郁或者严重昏迷等症状。JEV的爆发，常常局限在一定的地理气候位置上的分布，同时也具有明显的气候周期性，多数发生于夏秋两个季节，这两季也是蚊类散播传染病频繁产生的季节，属于自然界的疫源性虫媒散播传染病。

当仔猪感染病毒后，往往很容易侵袭仔猪的脑部组织，从而出现一系列的神经系统的严重症状，甚至出现死亡的危险；母猪感染病毒后，在怀孕阶段，容易造成母猪流产、产生死胎；公猪感染乙型脑炎病毒后，可引起公猪的睾丸炎或不育，但致死率较母猪来说不高。实际上该病虽然死亡率较低，但其感染持续时间长，病毒危害范围大，容易造成严重的损失和威胁。

重组酶辅助扩增技术(Recombinase aided amplification,RAA)是近年新兴的一种核酸检测技术，该方法通过加入重组酶和结合蛋白，使得核酸扩增能在37-42℃条件下快速进行，一般在15-30min即可判定结果。RAA已被广泛应用于病原体的快速检测，与RT-PCR和RT-LAMP方法相比较，该方法检测时间更短，检测灵敏度与RT-qPCR和RT-LAMP基本一致。

针对乙型脑炎的病原的检测可以使用RT-PCR、RT-qPCR、RT-LAMP等方法进行检测，也有RT-RPA-LFD检测方法(梁辉.流行性乙型脑炎RT-RPA-LFD检测方法的建立与评价[D].华南农业大学,2016.)的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何快速检测乙型脑炎病毒或如何制备检测乙型脑炎病毒的RT-RAA试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了检测乙型脑炎病毒的试剂盒。所述试剂盒包括检测乙型脑炎病毒的组合物。所述组合物可包括引物JEV-RAA-F2、JEV-RAA-R1和探针。所述引物JEV-RAA-F2的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。所述JEV-RAA-R1的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。所述探针的核苷酸序列可如序列表中序列4所示。

上文所述试剂盒可为基于荧光RT-RAA技术的试剂盒。

上文所述试剂盒中，所述组合物还可含有RT荧光基础反应单元。所述RT荧光基础反应单元可包含单链DNA结合蛋白、重组酶、逆转录酶和/或DNA聚合酶。

所述RT荧光基础反应单元可来源于荧光型RT-RAA核酸扩增试剂盒。所述RT荧光基础反应单元可为冻干粉。

上文所述试剂盒中，所述组合物还可含有镁离子缓冲液。所述镁离子缓冲液可为和醋酸镁。

上文所述试剂盒中，所述探针具可有下述任一修饰或其组合：

A1)在所述探针的5’端起第31位碱基上标记荧光基团。

A2)在所述探针的5’端33位碱基标记淬灭基团。

A3)在所述探针的5’端的31位和32位碱基中间用四氢呋喃修饰。