[发明专利]用于靶多核苷酸测序的衔接子、构建体、方法和应用

说明书

本发明涉及用于靶多核苷酸测序的衔接子、构建体、方法和应用，其中通过反向核酸双链实现多核苷酸结合蛋白的停滞。本发明具有很多优势，比如停滞多核苷酸结合蛋白的能力高等。

技术领域

本申请属于生物分析检测的技术领域，具体涉及一种用于靶多核苷酸测序的衔接子、构建体、方法和应用。

背景技术

多核苷酸（如RNA或DNA）测序技术都有广泛应用。对多核苷酸，尤其是DNA的测序技术也一直在更新。

DNA测序技术从1977年以来已发展到第四代测序技术，除了第一代测序技术，第二代、第三代、第四代测序技术统称为下一代测序（NGS）技术。基因测序主要经历了从第一代的Sanger测序法，到第二代的边合成边测序、第三代的单分子测序和第四代纳米孔测序发展过程。相较于第一代测序技术，NGS技术因为通量提高、成本降低和测序周期缩短优势，得到更广泛的应用。

第四代纳米孔测序指的是DNA分子在电泳驱动下通过纳米微孔时，会因为DNA分子每个碱基的大小形状不同而引起特征性的电流变化，由此利用电子传导检测可确定DNA分子的碱基类型和排列顺序，实现了单分子测序。

在纳米孔测序技术中，未施加电势时，通常需要使多核苷酸结合蛋白停滞在靶多核苷酸上，防止多核苷酸结合蛋白沿靶多核苷酸进一步移动。但当靶多核苷酸与多核苷酸结合蛋白以及跨膜孔接触并施加电势后，可以移动停滞的多核苷酸结合蛋白，沿着待测多核苷酸序列进行移动，从而达到测序的目的。因此，存在对可以实现高效停滞多核苷酸结合蛋白的衔接子的需求。

现有技术中通常采用含有iSp18或iSpC3等无碱基基团的衔接子来停滞多核苷酸结合蛋白，iSp18或iSpC3等由于不含碱基，因此不会与多核苷酸结合蛋白结合，因此可用于停滞多核苷酸结合蛋白。但是这些衔接子也存在多种缺陷，比如无碱基基团是非天然氨基酸，合成包含这些无碱基基团的衔接子的效率低下，在合成过程中，整条链容易断裂，影响其功效。

发明内容

本发明人发现反向核酸双链区可以很好地实现多核苷酸结合蛋白的停滞，甚至仅使用1个反向碱基对就能实现解旋酶的停滞。

因此，本发明的第一方面涉及一种用于靶多核苷酸测序的衔接子，所述衔接子包含用于装载多核苷酸结合蛋白的第一区段和用于连接靶多核苷酸的第二区段，所述第一区段和所述第二区段之间设反向核酸双链区段，所述反向核酸双链区段与所述多核苷酸结合蛋白接触之后能够停滞所述多核苷酸结合蛋白。

优选地，在所述衔接子中，所述第一区段上用于装载多核苷酸结合蛋白的多核苷酸结合蛋白结合位点与所述反向核酸双链区段连接，所述第二区段与所述反向核酸双链区段连接形成与所述靶多核苷酸连接的核酸双链区。

优选地，所述反向核酸双链区段包括或是由反向碱基基团形成的一个或多个相同或不同的互补碱基对。

优选地，所述反向核酸双链区段含有或是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个相同或不同的反向碱基对，更优选1、2、3、4或5个相同或不同的反向碱基对。

所述反向碱基基团选自反向胸苷（反向dTs）、反向腺苷（反向dAs）、反向鸟苷（反向dGs）、反向胞苷（反向dCs）、锁核酸 (LNA)或其他形成反向核酸双链的化学基团中的一种或多种。

优选地，所述衔接子还包含与所述反向核酸双链区段在远离所述靶多核苷酸的一侧连接的第三区段，所述第三区段包含用于与系链结合的游离末端，所述系链与跨膜孔或所述跨膜孔所在的膜结合。

更优选地，所述反向核酸双链区段的一端的两条链分别与所述第一区段和所述第三区段连接，所述反向核酸双链区段的另一端与所述第二区段的一端连接，所述第二区段的另一端与所述靶多核苷酸连接。