[发明专利]一种鉴定硝化微生物的方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种鉴定硝化微生物的方法。本发明利用¹⁵N‑Urea和¹⁵N‑(NH₄)₂SO₄同位素标记硝化种群，利用稳定同位素探针标记技术(¹⁵N‑DNA‑SIP)准确快速鉴定具有硝化活性的微生物。并可以结合同位素比值质谱仪或者硝化潜势评估各个硝化类群对硝化过程的相对贡献，为提高氮素利用效率，减少氮素损失和N₂O的排放提供基础。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种鉴定硝化微生物的方法。

背景技术

自基于DNA的稳定同位素探针(DNA-SIP)技术首次用于微生物生态研究(Radajewski et al.,2000)以来，近年来，它已被普遍用作将微生物的识别与特定环境过程联系起来的工具。除了少量纯培养实验外，大多数研究都是在复杂的生态系统中进行的，如土壤、沉积物、水和生物反应器。通常，在样品与这些底物一起孵育数小时至数周后(Jiang et al.,2015)，土壤微生物的DNA被提取并与CsCl和GB缓冲液混合。理想情况下，与相应的天然底物丰度相比，在等密度超速离心后，同化标记底物的微生物的DNA会以相对较重的密度分数出现。随后，标记的DNA被挑出并通过克隆文库或高通量测序进行分析，以确定代谢相关碳源的特定微生物群。

这些程序的关键步骤是在超浓缩后识别标记的分数。考虑到精度和灵敏度，Lueders等人(Lueders et al.,2004)选择了荧光测量和实时PCR来检测重层核酸。虽然该实验基于纯培养，但这种方法也广泛应用于土壤微生物研究。以往，¹³CO₂标记和¹²CO₂对照处理之间的成对比较用于评估硝化种群是否同化¹³CO₂进行自养生长，并利用¹³CO₂+C₂H₂和¹³CO₂+C₈H₁₄处理评估¹³CO₂同化对氨氧化微生物的化学自养依赖性，氨氧化可以被100pa的C₂H₂完全抑制。该方法鉴定硝化种群的依据是间接的，指向性不那么明确，能确定的只是硝化微生物的自养生长，而不是直接的鉴定硝化微生物利用氮底物生长。

现有的¹³C标记技术已广泛应用于土壤微生物研究，用于确定代谢相关碳源的特定微生物类群。但是对于确定代谢相关氮源的特定微生物类群尤其是氮循环所涉及的微生物仍有难度，并且由于土壤微生物群落结构和功能的复杂性，找到标记的组分并不容易。对于以氮为底物的特定微生物，DNA-SIP的应用更是由于氮价态的变化而增加难度。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种利用氮底物准确快速鉴定硝化微生物的方法。

本发明的上述目的通过如下方案方式实现：一种鉴定硝化微生物的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、对土壤进行预培养；

S2、取土壤分别加入¹⁴N-Urea、¹⁴N-(NH₄)₂SO₄、¹⁵N-Urea和¹⁵N-(NH₄)₂SO₄进行同位素微宇宙实验，分别孵育，然后分别提取土壤DNA；

S3、在DNA中加入CsCl溶液和GB溶液,调节折光率，然后进行超高速离心,然后进行分层纯化得到不同密度层级的DNA溶液；