[发明专利]一种用于检测克氏原螯虾白斑综合征病毒的金纳米探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于检测克氏原螯虾白斑综合征病毒的金纳米探针的制备方法，其特征在于由抗WSSV VP664多克隆抗体与表面修饰protein A的金纳米颗粒共同孵育，然后纯化制备得到所述的金纳米探针。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于表面修饰protein A的金纳米颗粒粒径为10-20nm，优选15nm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的抗WSSV VP664多克隆抗体通过以下方法制备得到：

(1)从GenBank中获取编码WSSV核衣壳蛋白VP664的基因序列，序列号为：AF440570.1，设计引物VP664F/VP664R扩增目的基因，以提取的WSSV DNA为模板，进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；将上步回收纯化的目的基因和质粒pET-28a(+)双酶切，纯化后进行连接，连接产物转化到DH5α感受态细胞中，利用PCR鉴定阳性菌，并将阳性菌进行测序；

(2)提取上一步的测序鉴定的阳性菌的质粒，将鉴定正确的质粒转化至BL21感受态细胞中进行诱导表达；

(3)超声破菌得到粗蛋白溶液，采用Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化在包涵体中表达的、带His标签的重组蛋白；

(4)将纯化的重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后皮下多点注射免疫青壮年新西兰白兔，加免完7天后采集全血测定效价，取免疫兔子的血清进行抗体纯化得抗WSSVVP664多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于每20μL金纳米颗粒结合约1μg的抗WSSVVP664多克隆抗体。

5.按照权利要求1-4中任一项所述的方法制备得到的金纳米探针。

6.权利要求5所述的金纳米探针在制备快速检测对虾白斑综合征病毒的试剂中的应用。

7.一种非疾病诊断目的的检测对虾白斑综合征病毒的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)利用权利要求5所述的金纳米探针标记WSSV；

(2)暗场显微镜观察样品。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)将所述的金纳米探针和纯化的WSSV以及PBST混合均匀，离心弃上清，沉淀即为金纳米探针标记的WSSV。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的金纳米探针和纯化的WSSV以及PBST的体积比为(40-55):1:(18-210)，优选50:1:200。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，取上一步沉淀用PBST重悬，调整使适宜浓度后通过暗场显微镜观察样品，同时设置金纳米探针和纯化的WSSV作为阴性对照；金纳米探针在单分散状态下散射光很弱，在暗场显微镜下不易观察到，金纳米探针与WSSV的结合样品在暗场显微镜下呈现出明亮的金黄色椭圆形结构，明显区别于暗场背景和阴性对照。