[发明专利]一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒，属于分子生物学技术领域。首先构建游离DNA基因文库，经重亚硫酸盐处理后，进行PCR扩增，通过磁珠纯化，纯化的产物进行甲基化探针液相杂交，对混合物中的DNA甲基化片段进行捕获，然后经纯化得到捕获后产物片段，扩增后利用磁珠对扩增产物进行纯化回收，得到上机文库，使用Illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得目标区域内甲基化突变情况。本发明的检测方法能够一次性获得样本多个基因目标区域甲基化突变信息，使得对目标基因区域进行高通量、高灵敏度、高准确度的甲基化检测成为现实。

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒。

背景技术：

恶性肿瘤目前已成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，在充分有效且不良反应极低的抗肿瘤药物被开发之前，肿瘤的早期发现仍然是降低肿瘤病死率的最有效方法。早期原位肿瘤在发生转移之前，可以通过手术切除，但肿瘤一旦发生转移，则很难通过手术根治。从肿瘤细胞产生到发生转移之前的窗口期，是检测和诊断肿瘤的黄金时期。研究表明，初期转移肿瘤患者的预后效果明显优于已发生转移的晚期肿瘤患者。对于多数肿瘤患者，早期发现能够使患者得到及时的治疗，并拥有更大的治愈机会。因此，癌症的早筛具有重要的医学价值和社会价值，且肿瘤的早期发现能够极大的提高治愈率、降低死亡率、降低治疗副作用和治疗费用。近年来随着表观遗传学研究的进展，DNA甲基化已经成为目前研究最多且最清楚的表观修饰方式，在肿瘤的发生发展中，DNA甲基化异常是其重要的诱因，其在肿瘤发生的早期阶段即可发生并具有组织特异性，提示了甲基化可以作为新的肿瘤分子标志物具有独特的优势。

DNA甲基化是表观遗传中最常见的一种修饰现象，指的是甲基转移酶将一个甲基基团可逆地添加到DNA序列中胞嘧啶的第五号位置的碳原子上面，从而形成5-甲基胞嘧啶。DNA的甲基化与许多人类复杂的疾病有关，包括癌症、肥胖和肥胖相关疾病、糖尿病、神经退行性疾病及年龄相关的常见疾病等。由于DNA甲基化而导致的基因沉默，在胚胎的早期发育、基因组印记和X染色体失活等诸多方面起着重要的作用，但是某些基因的异常甲基化也会使得基因表达调控发生紊乱，进而导致疾病的发生。所以DNA的甲基化状态与癌症密切相关，异常的甲基化能够在早期癌症中被检测到，因此，DNA的甲基化状态可以用来作为泛癌种诊断的标志物。

高通量测序(High-Throughput Sequencing)又称为下一代测序(NextGenerationSequencing，NGS)，通过NGS技术能够同时处理数以百万计的基因片段，相较于第一代测序方法，它的基因检测的灵敏度更高，效率更快且耗费成本更低，能够实现大规模的高通量、高深度并行测序。NGS技术的特点使其迅速运用在医学基础与临床的研究，在检测病原微生物、药物基因组、各类遗传病，尤其是在肿瘤基因学方面发挥的巨大的作用。NGS技术广泛应用于实体肿瘤中，发现了更多新的基因突变，在人类恶性肿瘤变异遗传途径的研究中发挥了重大的作用。虽然NGS测序与传统的Sanger法测序相比成本大大降低，但全基因组测序成本仍然较高，且许多研究应用并不需要全基因组测序，而对于一个或多个样本的目标区域测序的需求较为迫切，因此对目标区域有针对性地测序方法能够显著地降低测序成本，同时也能缩短测序时间和生物信息分析周期。