[发明专利]用于真核微生物快速计数的试剂、装置及方法

说明书

本发明公开了用于真核微生物快速计数的试剂、装置及方法，所述试剂包括渗透缓冲液、荧光染色液以及复溶液；其中，所述渗透缓冲液包括以下组分：ε‑聚赖氨酸、十二烷基‑β‑D‑麦芽糖苷、甘氨酸；所述荧光染色液中染色组分选自荧光素二乙酸酯、5(6)‑羧基‑2',7'‑二氯荧光素二乙酸酯、5‑氯甲基荧光素二乙酸酯、5(6)‑羧基荧光素二乙酸酯、6‑羧基荧光素二乙酸酯、5‑羧基荧光素二乙酸酯、5‑硝基‑二乙酸荧光素和6‑硝基‑二乙酸荧光素中的一种或几种。本发明的试剂利用广谱抑菌剂ε‑聚赖氨酸作为载体运输荧光染色液穿透细胞壁进入菌体细胞质中的作用，经激发光激发而产生荧光，菌落被识别计数，配合使用可以加速菌体生长速率的培养基，大大提高了微生物检测效率。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于真核微生物快速计数的试剂、装置及方法。

背景技术

微生物个体微小、种类繁多，包括细菌、真菌、病毒等群体。微生物菌落，是由单个或多个微生物细胞在适宜条件下培养后生长繁殖而形成的能够被我们所识别的细胞集团。微生物菌落数量监测分析在多个行业中应用广泛，对于保障产品的质量与安全至关重要。

近年来，随着经济的快速发展，人们生活水平得到了显著提高，人们对于生活品质的要求越来越高，关于食品、医药、化妆品及环境等卫生问题的曝光率增加明显，其中，霉菌和酵母数量超标是一大重点问题。

目前，霉菌和酵母菌落数量的相关检测标准有：GB 4789.15-2016《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》、GB/T 13092-2006《饲料中霉菌总数测定方法》、SN/T 4675.28-2016《出口葡萄酒中细菌、霉菌及酵母的计数》、ISO16212-2017《化妆品微生物学酵母与霉菌的计数》等，均采用的是传统的平板计数法。该方法准确性相对较高，数据重现性较好，但是操作过程复杂，对专业技能有一定要求，并且检测周期长，时效性差，检测结果具有滞后性，待样品中污染的微生物种类和数量搞清楚后，一些损失已经无法挽回。

随着现代生物技术水平的快速提高，微生物快速检测方法不断涌现，如显色培养计数法、测试片法、ATP生物发光法等。其中，显色培养基计数法是利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应而显色的原理来检测微生物的新型方法；测试片法可以说是改良版的显色培养计数法，利用纸片、无纺布等作为实验载体，承载相应的显色培养基，只需加入待检液，经过一定时间的培养后，对所要测试的微生物生长和变化情况进行判断，从而确定食品中微生物的种类和数量。显色培养计数法和测试片法都是在传统的平板计数法基础上改进的微生物检测方法，二者均是利用菌落显色原理而实现菌体标记易于识别的效果，但在检测时间上与传统方法相比优势不大。测试片法虽然在检测步骤上简化较多，省去了培养基的配置、灭菌、分装等操作，使用方便，但是其常用载体滤纸、无纺布等由于间隙较大，部分菌体在其中生长从而无法被观察到，导致计数结果比实际偏低，尤其是对于菌量较大的样品，常会出现菌落显示模糊，边界不清晰的情况，造成计数困难，其检出效果大打折扣。ATP生物发光法操作简便、快速、高效，但是其检测灵敏度有限，检测结果的准确性依赖于外部校准，并且属于破坏性荧光标记，无法用于后期溯源分析。

薄膜过滤计数法在《中华人民共和国药典》中是药品微生物限度检查的一种重要技术手段，在进出口食品，如饮料、葡萄酒等食品相关微生物检测标准中也有应用。样品稀释液在使用滤膜过滤后，将滤膜转移至相应培养基中进行扩大培养，待一定时间后取出并计数，能够满足大体积样品的微生物检测需求，尤其适用于检测含有微生物生长抑制剂的样品。荧光染色计数法通过荧光标记微生物细胞，在短时间内快速积累放大信号，从而实现检测效果。该技术检测灵敏度高、周期短，能够实现真正意义上的快速检测。

综上所述，目前对于真核微生物的检测，尤其是真菌细胞壁结构复杂坚韧，荧光染料直接进入困难，染色效率不高，以及存在着检测操作困难、抑制剂、残渣干扰、容易二次污染等问题，导致真核微生物检测分辨率、计数灵敏度低的问题。如何研发一种将薄膜培养与非破坏性荧光染色这两项技术结合起来，提高检测灵敏度和便捷性，是亟待解决的技术问题。

发明内容