[发明专利]人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法、表达和纯化方法

说明书

本发明公开了一种人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，包括如下步骤：1)以表达PAK1蛋白的基因序列为模板，采用PCR扩增获得PAK1基因片段；2)将得到的PAK1基因片段连接到真核表达载体上得到重组质粒；3)将得到的重组质粒进行转染转化复制，得到人PAK1蛋白的真核表达载体。还公开了利用真核表达系统进行重组人PAK1蛋白表达的方法：还包括步骤4)利用步骤3)获得的人PAK1蛋白的真核表达载体扩增纯化得到的质粒转染进入真核细胞中进行表达。还公开了获得重组人PAK1蛋白的方法：还包括步骤5)将步骤4)得到的阳性克隆进行培养扩大体系，收集培养细胞，离心收集上清，通过色谱柱纯化，即得。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，涉及重组蛋白真核表达技术，尤其涉及一种人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法、表达和纯化方法。

背景技术

蛋白激酶(protein kinases，简称PK)，是催化蛋白质磷酸化过程的酶。蛋白质的磷酸化过程是神经信息在细胞内传递的最后环节，导致离子通道蛋白及通道门的状态变化，是体内信号通路极其重要的组成部分，在神经细胞内有许多种类。因此，蛋白激酶的活力受到多种方式的调控，其中一种很常见的方式就是自磷酸化激活。PAK(p21-activatedkinase)蛋白家族在多种细胞过程中起着重要的作用，也受到相当精细的调控；PAK1是这个家族的代表性成员，其活力受到其N 端调控结构域及自磷酸化反应的调节，其活化环上一个保守的苏氨酸位点的磷酸化是其激活所必须的。

目前有很多关于人PAK1蛋白重组及表达的方法，但都是利用大肠杆菌系统表达，另外一个事实是目前市售的PAK1蛋白单抗在建立PAK1蛋白检测方法时，绝大多数抗体都存在特异性差、灵敏度低的缺点。我们认为利用原核系统进行蛋白表达过程中，由于缺乏与天然PAK1蛋白相同的表达环境导致重组的PAK1蛋白与天然PAK1蛋白结构有差异之处，导致制备出来的单抗存在识别天然PAK1 蛋白特异性差和灵敏度低的缺点。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，包括如下步骤：

1)以表达PAK1蛋白的基因序列为模板，采用PCR扩增获得PAK1基因片段；

2)将步骤1)得到的PAK1基因片段连接到真核表达载体上得到重组质粒；

3)将得到的重组质粒进行转染转化复制，得到人PAK1蛋白的真核表达载体。

在上述技术方案中，步骤2)中所述真核表达载体为pcDNA3.1，将将步骤1) 得到的PAK1基因片段和pcDNA3.1分别采用限制性内切酶BamHI、EcoRI消化后，连接消化产物得到重组质粒。

或者，步骤2)中所述真核表达载体为pCMV-blank，先将步骤1)得到的PAK1 基因片段采用T载体克隆，鉴定测序正确的克隆质粒与pCMV-blank分别采用限制性内切酶ApaⅠ、PstⅠ消化后，连接消化产物得到重组质粒。

在上述技术方案中，步骤3)将得到的重组质粒转化大肠杆菌复制得到大量的重组质粒。

在上述技术方案中，所述步骤1)中PCR扩增采用的引物为PAK1-F/PAK1-R，引物序列为：

PAK1-F：5’-AGCTCAACTATGATCTTTTT-3’，

PAK1-R：5’-GAATATTTTCATCTCCTTTT-3’。

本发明的另一目的是提供一种利用真核表达系统进行重组人PAK1蛋白表达的方法，在前述的构建方法基础上，还包括如下步骤：

4)利用步骤3)获得的人PAK1蛋白的真核表达载体的正确重组子扩增纯化得到的质粒转染进入真核细胞中进行表达。