[发明专利]人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法、表达和纯化方法

权利要求书

1.一种人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以表达PAK1蛋白的基因序列为模板，采用PCR扩增获得PAK1基因片段；

2)将步骤1)得到的PAK1基因片段连接到真核表达载体上得到重组质粒；

3)将得到的重组质粒进行转染转化复制，得到人PAK1蛋白的真核表达载体。

2.如权利要求1所述的人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于：步骤2)中所述真核表达载体为pcDNA3.1，将将步骤1)得到的PAK1基因片段和pcDNA3.1分别采用限制性内切酶BamHI、EcoRI消化后，连接消化产物得到重组质粒。

3.如权利要求1所述的人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于：步骤2)中所述真核表达载体为pCMV-blank，先将步骤1)得到的PAK1基因片段采用T载体克隆，鉴定测序正确的克隆质粒与pCMV-blank分别采用限制性内切酶ApaⅠ、PstⅠ消化后，连接消化产物得到重组质粒。

4.如权利要求1所述的人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于：步骤3)将得到的重组质粒转化大肠杆菌复制得到大量的重组质粒。

5.如权利要求1-4任一项所述的人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中PCR扩增采用的引物为PAK1-F/PAK1-R，引物序列为：

PAK1-F：5’-AGCTCAACTATGATCTTTTT-3’，

PAK1-R：5’-GAATATTTTCATCTCCTTTT-3’。

6.一种利用真核表达系统进行重组人PAK1蛋白表达的方法，其特征在于：在权利要求1-5任一项所述的构建方法基础上，还包括如下步骤：

4)利用步骤3)获得的人PAK1蛋白的真核表达载体的正确重组子扩增纯化得到的质粒转染进入真核细胞中进行表达。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤4)所述真核细胞包括用于外源基因表达的CHO细胞、COS-7细胞、NSO细胞、酵母、昆虫细胞及人源细胞，所述转染采用脂质体法转染。

8.一种获得重组人PAK1蛋白的方法，其特征在于：在权利要求6或7所述的方法步骤基础上，还包括步骤5)：

5)将步骤4)得到的阳性克隆进行培养扩大体系，收集培养细胞，破碎细胞，离心后收集上清，通过色谱柱将目的蛋白纯化，即获得高纯度重组人PAK1蛋白。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，收集培养细胞，采用超声破碎法破碎细胞，离心后收集上清，使用Ni柱进行亲和层析。

10.一种重组人PAK1蛋白的真核表达体系，其特征在于：是采用权利要求1至5任一项所述的方法构建得到的人PAK1蛋白的真核表达载体转染真核细胞得到的表达体系，所述真核细胞选自用于外源基因表达的CHO细胞、COS-7细胞、NSO细胞、酵母、昆虫细胞及人源细胞。