[发明专利]一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用

说明书

本发明公开了一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用，该引物组合由外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB组合而成；将上述引物组合应用于实时荧光环介导等温扩增(RealAmp)技术，能实现对乳制品中是否含有阪崎克罗诺杆菌进行检测。本发明的引物组合特异性强、检出极限低；本发明的检测方法中外引物、内引物和环引物的终浓度比例适宜，适用于乳制品的质量检测，能够特异、灵敏且快速检测乳制品中是否含有阪崎克罗诺杆菌。

技术领域

本发明属于乳制品质量检测技术领域，涉及一种引物组合及应用，具体地说是一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用。

背景技术

阪崎克罗诺杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，周身分布着有动力的鞭毛，多数产黄色素，是乳制品中的一种污染菌，能够快速且大量在婴儿配方奶粉及其它乳制品中繁殖。它对早产、出生体重轻及患病婴儿等免疫能力较弱的婴儿具有较大威胁，能引起新生儿败血症、脑膜炎和坏死性小肠结肠炎，低浓度的阪崎克罗诺杆菌感染即可导致婴幼儿患病。因此，加强对乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测力度极其重要。

对乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测离不开基因扩增。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种新型核酸扩增技术，其原理是针对靶基因的6个区域设计4条或6条引物，利用置换链DNA聚合酶在等温条件下保持1h左右，即可完成扩增，可通过观察扩增产物的荧光颜色或浊度变化进行结果判读。实时荧光环介导等温扩增(RealAmp)是在LAMP反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号来实时监控LAMP反应的进程，具有特异性强、灵敏度高、耗时短且无需昂贵的热循环设备等优点。

传统的食品中阪崎克罗诺杆菌的检测步骤复杂且周期较长，一般需要5天以上才能得到结果，且结果准确性和特异性都不高，易产生假阳性结果，需要反复验证，而目前没有特异性强且检出极限低的阪崎克罗诺杆菌RealAmp检测体系。

发明内容

本发明的目的，是提供一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用，基于阪崎克罗诺杆菌gyrB基因设计特异性引物组合及RealAmp反应体系，达到通过应用于RealAmp技术，实现特异性强、检出限低且能快速检测乳制品中是否含有阪崎克罗诺杆菌的目的。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种引物组合，由外引物、内引物和环引物组合而成，所述外引物、内引物和环引物及其序列分别为：

外引物F3：5’-CCGTTAAAGTGCC-3’、

外引物B3：5’-GCTTTACGTGCCGC-3’、

内引物FIP：5’-TGCTGCTCAACCGCCGATTTCTCCTCCCAGACCAAAGACA-3’、

内引物BIP：5’-GATGAACGAGCTGCTGGCCGTCGATAATTTTGCCGA-3’、

环引物LF：5’-CACCTCGGAGGAGACC-3’和

环引物LB：5’-CTGCTGGAGAACCC-3’。

本发明还提供了一种引物组合在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用。

作为一种限定，所述一种引物组合在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测方法，是以模板为待测乳制品中的DNA、引物为所述的一种引物组合的RealAmp反应体系进行反应，实时监测荧光强度，反应结果呈阳性则待测样品中含阪崎克罗诺杆菌，反应结果呈阴性则待测样品中不含阪崎克罗诺杆菌。