[发明专利]一种突变型蛋白酶3和生物素的偶联物及其制备方法及应用

说明书

本发明提供一种突变型蛋白酶3和生物素的偶联物及其制备方法及应用。所述的突变型蛋白酶3的氨基酸序列的36位点、48位点或74位点的氨基酸突变为带有叠氮基团和炔基中的一者的非天然氨基酸，所述的生物素为具有炔基或叠氮基团中的另一者的生物素衍生物，所述的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物由所述的非天然氨基酸和所述的生物素衍生物发生点击化学反应而得。本发明可操作性强，反应效率高，条件温和，在提高了生物素标记效率的同时，增强了抗原抗体结合的反应性，提高了抗蛋白酶3抗体检测的灵敏度和准确性，在临床应用中具有广阔前景。

技术领域

本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及一种突变型蛋白酶3和生物素的偶联物及其制备方法及应用。

背景技术

蛋白酶3(PR3)是中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒中的一种丝氨酸蛋白酶，分子量约为29Ka的糖蛋白。PR3能降解多种细胞外基质如弹性蛋白、血红蛋白、Ⅳ型或Ⅴ型胶原等多种组织成分。蛋白酶3还能通过组织蛋白酶G促进血小板活化，并使C抑制剂失活。PR3抗体是韦格拉肉芽肿病(恥G)的特异性抗体。尽管其发病机制不清，但是抗PR3抗体与韦格拉肉芽肿病发病机制具有一定的相关性。另外，PR3抗体浓度与其他疾病活性密切相关，可见于原发性系统性脉管炎、慢性炎性肠炎、感染(如HV和其他疾病。韦格纳肉芽肿患者经治疗病情稳定后，该抗体浓度可下降，常被作为判断疗效、估计复发的指标，从而指导临床治疗。PR3抗体对呼吸道有亲和性，致上下呼吸道坏死，肉芽肿形成。此外，蛋白酶3抗体(抗-PR3)在血管炎的发病中也起着重要作用，蛋白酶3抗体(抗-PR3)的检测结果在原发性小血管炎患者检测中具备较高的临床价值。

随着检测技术的发展，间接化学发光检测法已成为抗蛋白酶3抗体主要的检测手段。该方法的关键是将蛋白酶3偶联至纳米磁微粒，用于捕获样本中的抗蛋白酶3抗体。

在现有的技术中，将带有活性基团的磁珠与蛋白酶3表面的游离基团(-NH₂或-COOH)反应，获得包被了蛋白酶3的纳米磁微粒。由于蛋白酶3表面存在较多游离-NH₂或-COOH，因此蛋白酶3与磁微粒的偶联位点及摩尔比不能确定，一个蛋白分子可结合多个磁微粒，这些磁微粒可能直接与抗原表位结合或是在空间上遮蔽抗原表位，最终影响抗原抗体结合效果，降低检测信号值，导致试剂盒灵敏度不足，阳性率低的缺点，存在漏检或误检等风险。

利用叠氮和炔基的点击化学反应在生物分子体系中进行修饰是近年来研究的热门领域。CN112147335A专利公开了一种基于点击化学的标记配体组合物，其通过叠氮基团与叠氮反应基团之间的点击化学反应实现蛋白偶联标记。该专利选用表面带有羧基、氨基和巯基等其他具有化学活性的功能基团的蛋白，通过这些功能基团与提供叠氮反应基团或叠氮基团的第一点击化学试剂偶联，其蛋白表面将会偶联较多叠氮反应基团或叠氮基团，因此无法实现定点标记，还可能会遮蔽蛋白的抗原表位，影响抗原抗体结合能力，而由于蛋白表面与多个叠氮基团或叠氮反应基团结合，因此在与磁珠偶联时，一个蛋白分子可能结合多个链霉亲和素磁珠，同样会导致抗原表位被遮蔽，且提高了制备成本。另外，采用化学反应将点击化学试剂与目的蛋白偶联的步骤较多，耗时较长，影响蛋白活性，甚至导致蛋白变性。因此，该方法不适合蛋白酶3与生物素的偶联。

因此，亟需开发一种能够避免偶联过程中生物素遮蔽蛋白酶3的抗原表位，能够简化传统生物素标记抗原蛋白过程，具有较高的抗体结合能力，并且可明显提高抗体体外检测的灵敏度和准确性的突变型蛋白酶3和生物素的偶联物。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗体结合能力好、可明显提高抗体体外检测的灵敏度和准确性的突变型蛋白酶3和生物素的定点偶联物。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：