[发明专利]一种检测西瓜嗜酸菌的RPA引物对和crRNA及其试剂盒和使用方法

说明书

本发明属于病原微生物的快速检测领域，特别是指一种检测西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）的RPA引物对和crRNA及其试剂盒和使用方法。所述RPA引物对序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，crRNA靶标序列如SEQ ID No.3所示。本发明将采用Crispr/LbCas12a核酸检测平台，针对西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）的基因组设计特异性检测位点，并结合荧光可视化技术，开发出适合检测此类病原菌的简易性诊断方法。同时结合RPA等温扩增技术，进一步提高灵敏度。

技术领域

本发明属于病原菌的快速检测领域，特别是指一种检测西瓜嗜酸菌（Acidovoraxcitrulli）的RPA引物对和crRNA及其试剂盒和使用方法。

背景技术

细菌性病菌常常导致全世界蔬菜和水果生产区产量和质量的显著下降，从而对园艺产业造成严重的威胁。其中，西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）在葫芦科作物中会引起细菌性果斑病，它是世界范围内瓜类作物的主要限产病原菌，会对市面上的西瓜、甜瓜等水果产业造成毁灭性伤害。由于其对园艺作物的破坏性影响，西瓜嗜酸菌在国内外的农业植物病虫害检疫表中均被列为检疫性有害生物（EPPO全球数据库；https://gd.eppo.int/datasheets/）。目前，西瓜嗜酸菌在全球大部分种植地区的已经成为地方性疾病，而其最主要的传播和扩散方式是通过种子，采用简单、快速、敏感的现场检测技术对病原菌污染种子的批次进行排除是十分重要的检疫措施。

成功的检疫措施需要一种准确、及时、就地和简单的病原菌检测方法，以便就地销毁传染性材料。根据欧洲植物保护组织（EPPO）的指导方针推荐的病原菌的鉴定标准，A. citrulli的鉴定需要分离、纯化、培养和生理生化分析等一系列步骤，此外还需要分子技术如PCR或RT-PCR进行进一步确认。然而，这些方法在耗时的同时，还需要建立实验室，购买昂贵的仪器以及培训专业操作人员，这使得其不易携带，不适合在基层部门进行即时检测。

基于CRISPR-Cas蛋白（Cas12、Cas13和Cas14）的核酸检测系统，近几年在在分子诊断方面也有很大的应用前景，因为它们在结合靶标触发顺式切割后，在非特异性靶标上显示出反式切割。其中，Cas12a系统通过识别特定的dsDNA序列对ssDNA进行非特异性切割，特别适合于检测来自病毒的靶标位点、病原菌或转基因生物。

发明内容

本发明提出一种检测西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）的RPA引物对和crRNA及其试剂盒和使用方法，本发明将采用Crispr/LbCas12a核酸检测平台，针对西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）的基因组设计特异性检测位点，并结合荧光可视化技术，开发出适合检测此类病原菌的简易性诊断方法。同时结合RPA等温扩增技术，进一步提高灵敏度。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种检测西瓜嗜酸菌的RPA引物对和crRNA，所述RPA引物对序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，crRNA序列如SEQ ID No.3所示。

含有上述的RPA引物对和crRNA靶标的试剂盒，所述试剂盒包括2μL RPA扩增产物体系和50 μL crRNA/LbCas12a混合体系。

所述RPA扩增产物体系包括RPA酶粉、29.5μL复水缓冲液、11μL无核酸酶水、280 nM醋酸镁、2μL基因组DNA，使用商业TwistAmp Basic试剂盒（TwistDx）进行RPA预扩增。