[发明专利]一种检测西瓜嗜酸菌的RPA引物对和crRNA及其试剂盒和使用方法

权利要求书

1.一种检测西瓜嗜酸菌的RPA引物对和crRNA，其特征在于：所述RPA引物对序列如SEQID No.1和SEQ ID No.2所示，crRNA序列如SEQ ID No.3所示。

2.含有权利要求1所述的RPA引物对和crRNA靶标的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括2μL RPA扩增产物体系和50 μL crRNA/LbCas12a混合体系。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述RPA扩增产物体系包括RPA酶粉、29.5μL复水缓冲液、11μL无核酸酶水、280 nM醋酸镁、2μL基因组DNA。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述crRNA/LbCas12a混合体系包括100nM LbCas12a、120 nM crRNA、400 nM ssDNA FQ-reporter、20 U RNase抑制剂、5 μL 10×NEBuffer 3.1和ddH₂O共50 μL。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中RPA引物对中的正反引物的浓度为10 μM，含量为2.5 μL；FQ-reporter序列为5’-FAM-TTATT-Quencher-3’。

6.权利要求2-5任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将冻干后的RPA酶粉用10 μM RPA引物对、复水缓冲液、无核酸酶水和待测种子的微生物基因组DNA混合得反应体系；

（2）向步骤（1）的反应体系中加入280 nM的醋酸镁，离心启动反应，孵育得初产物；

（3）制备crRNA/LbCas12a混合体系并加入2 μL步骤（2）的初产物，在Bio-Tek FLx800微孔板荧光阅读器上进行反式切割反应并观察结果。

7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于：所述步骤（1）中10 μM RPA引物对的体积为2.5 μL、复水缓冲液的体积为29.5 μL、无核酸酶水的体积为11 μL、待测种子的微生物基因组DNA的体积为2 μL。

8.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于：所述步骤（2）中280 nM的醋酸镁的体积为2.5 μL，孵育的条件为37 ℃孵育30 min。

9.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述步骤（3）中crRNA/LbCas12a混合体系的制备步骤为：先将100 nM LbCas12a和120 nM crRNA预先混合并在25 ℃下预孵育10min以促进crRNA/LbCas12a复合物的形成，然后再加入400 nM ssDNA FQ-reporter、20 URNase抑制剂、2 μL RPA扩增产物、5 μL 10×NEBuffer 3.1组成反应体系并添加ddH₂O至50μL。

10.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于：所述步骤（3）中反式切割反应的温度为37℃；观测方式为每30 s在λex：485 nm；λem：535 nm处测量一次荧光或者在254 nm紫外光下进行肉眼观测。