[发明专利]用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用

权利要求书

1.用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合，其特征在于：包括与膀胱癌人群早期甲基化位点相关的3对靶标特异引物、3个特异性引物探针及对应的内参引物、内参引物探针；其中所述3对靶标特异引物的序列如下：

Seq ID NO.1：F-TCGCCACCGACCCCACTAC，

Seq ID NO.2：R-GCATTCTCCACGATTGAGCGCACAG；

Seq ID NO.3：F-GAGATCTTGCGCCTCTTGTCCTTG，

Seq ID NO.4：R-CAAGAAACGCATTCCGTACAGC；

Seq ID NO.5：F-TTGACAGCAGGCATCAGCGTA，

Seq ID NO.6：R-CCAAGGATATCGAAGGCTTGCTGG；

内参引物的序列如下：

Seq ID NO.7：F-GGTGCCAGATTTTCTCCATGTCGTC，

Seq ID NO.8：R-ACGAGGCCCAGAGCAAGAGA；

所述特异性引物探针序列如下：

Seq ID NO.9：FAM-ACAACCCGCAGAACCGAAGCTCC-BHQ1，

Seq ID NO.10：FAM-TTGTTAGCCGCATACTCCCGCTCC-BHQ1；

Seq ID NO.11：FAM-TCGCCCACTCCCCTCTGACC-BHQ1；

内参引物探针序列如下：

Seq ID NO.12：VIC-TACCCCATCGAGCACGGCATCGTC-BHQ1。

2.用于膀胱癌早期筛查的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合及甲基化敏感内切酶体系。

3.根据权利要求2所述用于膀胱癌早期筛查的试剂盒，其特征在于：所述甲基化敏感内切酶体系包含HinP1I、HpaII、AciI。

4.根据权利要求3所述的试剂盒在制备膀胱癌早期筛查试剂中的应用，其特征在于筛查方法包括以下步骤：

S1.提取尿液中游离的cfDNA；

S2.将cfDNA与甲基化敏感内切酶体系在37℃下孵育；

S3.将孵育产物作为模板，加入如权利要求3所述的试剂盒中的3对靶标特异引物及内参引物，进行多重PCR扩增；

S4.将扩增产物作为模板，加入如权利要求3所述的试剂盒中的3对靶标特异引物、3个特异性引物探针、内参引物探针及内参引物，进行qPCR检测反应；

S5.根据3对靶标特异引物与内参引物的Ct值之差ΔCt，评估膀胱癌风险；所述S5的评估方式为：

ΔCt＝3对引物特异扩增Ct值-内参引物扩增Ct值；

ΔCt4.89胃部肿瘤低风险；

ΔCt≤4.89胃部肿瘤高风险。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S1具体为：采用Qiagen血浆游离DNA提取试剂盒提取尿液中的cfDNA。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S2的孵育条件为：37℃孵育16h，在80℃酶失活20min。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S3的扩增程序为：98℃/45s，8个循环；98℃/15s，55℃/30s，72℃/30s，8个循环；72℃/1min，1个循环；4℃/hold。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S4的qPCR检测反应程序为：95℃/3min，1个循环；98℃/15s，60℃/60s，45个循环。