[发明专利]一种精确鉴定草麻黄的方法

说明书

本发明提供了一种精确鉴定草麻黄的方法。具体是利用设计、筛选获得的引物，扩增并采用Sanger测序方法获得叶绿体基因rbcL及matK目的序列，通过与GenBank数据库比对，并计算遗传距离结合系统发育及特征核苷酸位点分析，区分草麻黄与其他物种的方法。步骤为：提取草麻黄植物基因组DNA，利用PCR技术，采用给定引物及程序扩增，并采用Sanger测序获得叶绿体基因rbcL和matK的目的序列，采用CExpress、Bioedit及MEGA 5.1等软件将草麻黄与麻黄属近缘物种进行多序列比对，分析得到稳定的种间遗传变异位点，并以K₂P模型计算它们的种内种间遗传距离，以邻接法构建系统发育树，综合分析以鉴别草麻黄与同属近缘物种。该方法具有稳定、高效、精确的特点，是从分子水平鉴定草麻黄植物和药材的良好方法。

技术领域

本发明属于药用植物物种鉴定，具体的说是涉及采用rbcL+matK组合条形码精确鉴别草麻黄与其他相似物种的方法。

背景技术

草麻黄(Ephedra sinica Stapf)，别名麻黄草、华麻黄、无叶草等，为麻黄属草本状灌木植物，是中华人民共和国《药典》收录的中药“麻黄”及“麻黄根”指定的主要基原植物。用途广、用量大，是我国许多经典名方的主要成分。

全世界麻黄属下有67个相似种，我国有15个种及4个变种，主要产于辽宁、吉林、内蒙古、河北、山西、河南西北部及陕西等省区，适应性强，常组成大面积的单纯群落。近年来，草麻黄市场需求量逐年上升，存在以次充好、物种混淆使用的现象，但市场上尚没有精确鉴定并区分草麻黄与其他相似物种的良好方法，这很大程度上限制了草麻黄用药安全及其现代化应用研究。

截止目前，草麻黄的鉴别多采用两种方法，一种是传统的形态鉴别法，该方法主要从植物外观、颜色、理化性质等指标区分，存在误差大、不够精密等缺点；第二种方法，是通过核糖体基因ITS、叶绿体chlB全基因、限制性片段长度多态性等分子生物学的方法分析，仅可以区分草麻黄与个别物种，或麻黄基原物种与其他物种，但无法精密而严格地区分草麻黄与木贼麻黄、中麻黄、膜果麻黄、山岭麻黄等众多同属近缘物种！而且这些方法存在成本高、操作步骤繁琐、样本分析规模较小等缺点。

本发明则通过开发物种间特异的matK条形码，并联合使用rbcL通用条形码对草麻黄进行鉴定，实现了草麻黄物种的精密鉴定。具有物种区分度高，操作方便、检测高效、结果可信等很多优点，是一种很有应用前景的方法技术。

发明内容

本发明的目的在于为鉴定草麻黄植物及药材提供matK基因特异性引物。

本发明的另一个目的在于提供采用通用引物扩增rbcL基因目的序列，以及采用上述引物扩增matK基因目的序列，将二者综合分析以鉴定草麻黄植物及药材的方法。

本发明提供及使用的引物，具体见表1

表1.草麻黄鉴定引物

本发明提供一种利用rbcL+matK组合条形码鉴定草麻黄的方法，步骤如下：

1)准备草麻黄植物干或者湿的样品；

2)基因组DNA提取：采用常规方法提取草麻黄植物的基因组DNA；

3)采用表1中rbL通用引物，PCR扩增叶绿体基因rbL目的序列；采用25μL PCR体系：2×SanTaq PCR Master Mix 12.5μL,引物各1μL(10μmol/L),模板DNA 2μL(100ng/μL),ddH₂O 8.5μL；扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性50s,55℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸10min；