[发明专利]一种精确鉴定草麻黄的方法在审
| 申请号： | 202111423266.3 | 申请日： | 2021-11-26 |
| 公开（公告）号： | CN114058730A | 公开（公告）日： | 2022-02-18 |
| 发明（设计）人： | 崔晋龙;蒋珊 | 申请（专利权）人： | 山西大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 山西五维专利事务所(有限公司) 14105 | 代理人： | 张福增 |
| 地址： | 030006 山*** | 国省代码： | 山西;14 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 精确 鉴定 麻黄 方法 | ||
1.一种草麻黄matK基因引物对，其特征在于，正向引物核苷酸序列为CTATGTTATAGATCCGAATC，反向引物核苷酸序列为CAACTTTTCCATCGAAGAG。
2.一种利用rbcL+matK组合条形码鉴定草麻黄的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)准备草麻黄植物干或者湿的样品；
2)采用常规方法提取草麻黄植物的基因组DNA；
3)采用rbL通用引物ATGTCACCACAAACAGAAAC和TCGCATGTACCTGCAGTAGC，PCR扩增叶绿体基因rbL目的序列；采用25μL PCR体系：2×SanTaq PCR Master Mix 12.5μL,浓度为10μmol/L的引物各1μL,浓度为100ng/μL的模板DNA 2μL,ddH2O 8.5μL；扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性50s,55℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸10min；
4)采用正向引物CTATGTTATAGATCCGAATC和反向引物CAACTTTTCCATCGAAGAG，PCR扩增叶绿体基因matK目的序列；采用25μL PCR体系：2×SanTaq PCR Master Mix 12.5μL,浓度为10μmol/L的引物各0.5μL,浓度为100ng/μL的模板DNA 2μL,ddH2O 8.5μL；扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s,52℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；
5)采用常规方法进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物；
6)采用Sanger方法双向测序；
7)采用CExpress软件拼接序列，并利用Bioedit及MEGA 5.1软件将麻黄属近缘物种进行多序列比对，分析得到稳定的种间遗传变异位点；以Kimura-2-parameter模型计算它们的种内种间遗传距离，进行“barcoding gap”分析；随后以邻接法构建系统发育树，利用Bootstrap1000次重复检验各分支的支持率，并选择保留50％含有空位的列，以相关类群即与麻黄目同一买麻藤亚纲(Gnetidae)下买麻藤属(Gnetum Linn)下模式种-显轴买麻藤Gnetum gnemon为Outgroup，综合分析以鉴别草麻黄与同属近缘物种。
3.如权利要求1所述的草麻黄matK基因引物对在鉴定草麻黄中的应用。
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