[发明专利]一种眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的表达载体和表达产物及其构建制备方法

权利要求书

1.一种眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的表达载体，其特征在于：所述的眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30和OH-CATH30R的表达载体是由DAMP4载体蛋白，通过linker分别连接眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30从N端到C端、从C端到N端基因构建载体质粒PET-28a-DAMP4-F-OH30、PET-28a-DAMP4-F-OH30R，具有凝血酶切割位点，其重组质粒诱导表达的重组蛋白均为140aa，其载体质粒PET-28a-DAMP4-F-OH30的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示，PET-28a-DAMP4-F-OH30R的的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

2.一种眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的表达菌株，其特征在于：所述的眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30和OH-CATH3R的表达菌株分别为含有PET-28a-DAMP4-F-OH30、PET-28a-DAMP4-F-OH30R载体质粒的TSsetta(DE3)Chemically Competent Cell表达菌株。

3.一种眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的表达载体和表达产物的构建制备方法，其步骤如下：

S1：重组表达载体PET-28a-DAMP4-F-OH30和PET-28a-DAMP4-F-OH30R的构建

所述的重组表达载体是由DAMP4载体蛋白，通过linker分别连接眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30 N端到C端、C端到N端基因构建PET-28a-DAMP4-F-OH30、PET-28a-DAMP4-F-OH30R；

S2:表达菌株的获得：将S1的重组表达载体用热击法转化到大肠杆菌top10感受态细胞，分别得到含有眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30和OH-CATH30R的重组PET-28a-DAMP4-F-OH30阳性克隆菌株和PET-28a-DAMP4-F-OH30R阳性克隆菌株，将阳性克隆菌株分别摇菌提取质粒，再用热击法将重组质粒PET-28a-DAMP4-F-OH30、PET-28a-DAMP4-F-OH30R转化至TSsetta(DE3)Chemically Competent Cell表达感受态细胞中，得到含重组质粒PET-28a-DAMP4-F-OH30、PET-28a-DAMP4-F-OH30R的TSsetta(DE3)Chemically Competent Cell表达菌株；

S3：重组表达工程菌的诱导表达：用将上述步骤S2得到的表达菌株进行诱导表达，得到融合表达表物DAMP4-F-OH-CATH30(DAMP4-OH30(ReOH30)和DAMP4-OH-CATH30R(DAMP4-OH30R(ReOH30R)；

S4：重组抗菌肽的分离、纯化：将上述S3步骤中表达产物经过离心收集菌体、菌体破碎后再经离心、分离纯化、透析、酶切，即得重组表达抗菌肽OH-CATH30(OH30)和OH-CATH30R(OH30R)；

S5：重组抗菌肽抑菌活性的测定

测定重组表达产物酶切反应前和经过凝血酶酶切后得到的产物对大肠杆菌25922菌株的抑菌效果。

4.根据权利要求3所述的一种眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的表达载体和表达产物的构建制备方法，其特征在于：所述的重组表达载体PET-28a-DAMP4-F-OH30的构建方法如下：全基因合成DAMP4-OH30，从NcoI和Hind III双酶切插入表达载体PET-28a而得到重组表达载体PET-28a-DAMP4-F-OH30。