[发明专利]一种眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的表达载体和表达产物及其构建制备方法

说明书

本发明公开了一种眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30的表达载体和表达产物及其构建制备方法，涉及一种可高效表达眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30和OH‑CATH30R的表达载体的构建与表达。眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30和OH‑CATH30R的表达载体由DAMP4载体蛋白，通过linker分别连接眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30N端到C端、C端到N端基因构建PET‑28a‑DAMP4‑F‑OH30、PET‑28a‑DAMP4‑F‑OH30R。通过该表达载体在TSsetta(DE3)Chemically Competent Cell表达感受态细胞中诱导表达可溶性产物和高效纯化可溶性表达产物的方法，从而获得有活性的体外抗菌肽OH‑CATH30和OH‑CATH30R表达产物。该方法实现了抗菌肽OH‑CATH30从N‑C和从C—N的原核表达，实验流程简单易行，获得的重组抗菌肽在纯化后不经任何处理即具有明显的抑菌活性，经凝血酶酶切之后抑菌活性有了明显的提高。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种爬行纲抗菌肽眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的表达载体和表达产物及其构建制备方法。

背景技术

抗菌肽(AMPs)作为治疗抗生素耐药病原体的小分子抗菌剂成为一种很有前途的替代品，在过去几十年里引起了广泛的关注。AMPs是一类由10-40个氨基酸残基组成的具有抗菌活性的多肽分子，由宿主基因编码，是宿主自身的免疫防御系统中重要的组成部分。天然AMPs已经在哺乳动物、两栖动物、昆虫和植物等中被发现。AMPs具有广谱的抗菌活性，能够在较短的时间内起到快速和高效的抗微生物作用，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌，以及一些包膜病毒和原生生物都具有较强的杀菌活性。

和传统的抗生素相比，AMPs具有快速且彻底的杀菌作用，从而不易产生细菌耐药性,且对哺乳动物具有极低的毒性。因此，在抗生素耐受严重的今天，AMPs成为了肽类药物的潜在候选药物，在新型抗菌药物研发方面具有广阔的前景。目前，已经报告并鉴定的AMPs有3000多种，并建立了AMPs数据库(http://aps.unmc.edu/AP/main.html),许多AMPs已经进入临床前研究和临床研究或者应用到畜牧业上去。现在已知的AMPs主要由两大家族组成，一类是包含多对二硫键的防御素家族；另一类是Cathelicidin家族。Cathelicidins是一个重要的AMPs家族，是一类具有广谱抗微生物活性，并在动物先天免疫系统中发挥重要作用的多功能抗菌肽。Cathelicidin抗菌肽首先是以无活性的前体蛋白形式表达。前体蛋白的前体由N端信号肽序列(29-30个氨基酸残基)，中间保守的Cathelin区域(94-114个氨基酸残基)和C端成熟肽序列(12-100个氨基酸残基)构成。前体蛋白通常情况下是没有活性的，被特异性的蛋白酶切割掉保守的cathelin-like结构域后即可释放出有活性的成熟肽，这可能是由于其N端所带的阴离子的片段抑制C端的阳离子，使生物体避免AMPs伤害自身细胞。迄今为止，在几乎所有种类的脊椎动物体内均发现有Cathelicidin抗菌肽,不同物种来源的成熟肽二级结构存在一定差异。根据Cathelicidin抗菌肽二级结构的差异，可以分为α-螺旋Cathelicindin、含有半胱氨酸的Cathelicindin以及富含脯氨酸或酪氨酸的cathelicindin。与其它家族,如defensins、hepcidins、昆虫AMPs和蛙科皮肤来源AMPs相比,cathelicidins家族表现出更强的抑菌活性。除此之外,Cathelicidins还参与免疫调节、促进细胞增殖以及迁移、抑制组织损伤和促进损伤修复、促进细胞因子和组胺释放、促进血管生成等其他重要的生物学功能。

同已经发现的大多数Cathelicidin相比，来源于眼镜王蛇的cathelicidin(OH-CATH30)具有更强，更广谱的抗菌活性，而且在高剂量下并没有发现明显的溶血活性。这些特点表明蛇来源的Cathelicidin有可能开发为全身性给药的抗细菌感染药物。但是从生物体中直接获取的天然Cathelicidin提取量比较少。