[发明专利]一种利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法

说明书

本公开是一种利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，包括：将细胞与基质胶混合均匀并锚定于培养类器官的类器官培养装置内；加入完全培养基，在类器官培养至刚刚形成隐窝时对类器官开始进行机械拉伸，直至类器官培养成熟。本公开创新性的将机械拉伸引入肠类器官培养，建立了有机械拉伸参与的类器官动态培养体系，解决了类器官静态培养忽略力学因素的问题，克服了传统类器官静态培养的缺点，挖掘了力学因素在类器官培养中的巨大价值。本公开应用机械拉伸诱导肠类器官生长和肠干细胞干性增强，提高了肠类器官的培养效率，有助于体外培养获得大尺寸、高成熟度的类器官，对于推动类器官再生生物学领域的研究和应用具有重要意义。

技术领域

本公开涉及类器官体外培养及分析技术领域，具体涉及一种利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法。

背景技术

类器官是利用干细胞的自组织潜能和记忆潜能体外构建的多细胞三维培养物，可以在细胞的类型、组织结构和功能方面模拟其相应的体内器官。近年来，类器官培养技术飞速发展，已报道成功培养的类器官有肠、肝脏、胃、胰腺、肺、视网膜、大脑、垂体、肾脏、子宫、前列腺、睾丸、内耳、乳腺等类器官，以及各种肿瘤组织类器官。体外培养的类器官在组织创伤修复和器官再生中展现出巨大潜力，也成为组织工程和再生医学发展的重要方向。

世界上首例类器官-小肠类器官的培养体系是由荷兰科学家Hans Clever建立的。用基质胶Matrigel裹挟原代小肠隐窝或Lgr5肠成体干细胞，在体外成功建立了具有肠结构特征的三维培养物，其包含肠上皮所有的细胞类群，保留了“陷窝-绒毛”形态结构，可以在体外长期维持，是研究肠上皮稳态的重要工具。

小肠作为重要的消化器官，其表面的粘膜层在正常发挥生理功能的情况下会受到多种力学因素的影响。例如：肠腔内相对较硬的食糜对肠道带来的压力、拉伸和剪切力，肠粘膜肠绒毛有节奏的运动会带来循环应力，此外，肠壁内部的肌肉通过收缩和舒张使得肠蠕动从而引起上皮细胞有节律的拉伸形变。除了直接影响肠生理功能的发挥，力学因素还作用于肠上皮生长发育和形态发生。例如，力学因素在肠道发育中扮演重要角色，肠道回转、绒毛形成以及肠道干细胞定位都与力学作用直接相关。

现行的肠类器官培养体系是单纯依赖生物因素(基质胶、生长因子和培养基)的静态三维培养系统，忽略了机械力等物理因素的作用，虽然培养出的类器官在一定程度上能够在细胞构成和组织结构上概括其对应器官的特征，但是相较于在体内动态复杂的生化物理环境中生长发育的组织器官而言，类器官和其对应器官仍存在较大差距，无法全面有效的模拟体内生理状态，因而有必要通过引入机械力因素完善肠类器官培养系统。

发明内容

本公开旨在提供一种利用机械力诱导肠类器官生长的类器官培养方法。

为达到上述目的，本公开提供了一种利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，包括：

步骤S1：将细胞与基质胶混合均匀并锚定于培养类器官的培养装置内；

步骤S2：加入完全培养基，在类器官培养至刚刚形成隐窝时对类器官开始进行机械拉伸，直至类器官培养成熟。

上述方案中，步骤S1中所述细胞为人源或动物来源的肠原代隐窝，或为肠类器官传代过程中被机械打散的碎片，或为通过酶解、分选得到的肠Lgr5-eGFP单细胞。

上述方案中，步骤S2中所述完全培养基包括Advanced DMEM/F12， B27，GlutaMAX，N-acetylcystene，以及生长因子R-Spondin1，Noggin和 EGF。

上述方案中，步骤S1中所述细胞为人源的肠原代隐窝时，所述完全培养基还需加入Gastrin，Nicotinamide，A83-01，prostaglandin E2和 SB202190；或者步骤S1中所述细胞为通过酶解、分选得到的肠Lgr5-eGFP 单细胞时，所述完全培养基还包括小分子CHIR99021和valproic acid。