[发明专利]一种利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法

权利要求书

1.一种利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，其特征在于，包括：

步骤S1：将细胞与基质胶混合均匀并锚定于培养类器官的类器官培养装置内；

步骤S2：加入完全培养基，在类器官培养至刚刚形成隐窝时对类器官开始进行机械拉伸，直至类器官培养成熟。

2.根据权利要求1所述的利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，其特征在于，步骤S1中所述细胞为人源或动物来源的肠原代隐窝，或为肠类器官传代过程中被机械打散的碎片，或为通过酶解、分选得到的肠Lgr5-eGFP单细胞。

3.根据权利要求2所述的利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，其特征在于，步骤S2中所述完全培养基包括Advanced DMEM/F12，B27，GlutaMAX，N-acetylcystene，以及生长因子R-Spondinl，Noggin和EGF。

4.根据权利要求3所述的利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，其特征在于，

步骤S1中所述细胞为人源的肠原代隐窝时，所述完全培养基还需加入Gastrin，Nicotinamide，A83-01，prostaglandin E2和SB202190；或者

步骤S1中所述细胞为通过酶解、分选得到的肠Lgr5-eGFP单细胞时，所述完全培养基还包括小分子CHIR99021和valproic acid。

5.根据权利要求1所述的利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，其特征在于，步骤S1中所述的类器官培养装置采用可拉伸材料底膜，用于配合机械拉伸的加载。

6.根据权利要求1所述的利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，其特征在于，步骤S2中所述在类器官培养至刚刚形成隐窝时对类器官开始进行机械拉伸，是在类器官培养至刚刚“出芽”的状态时对类器官开始进行机械拉伸，其中对于小鼠原代隐窝需要培养2-3天，对于类器官传代需要培养1-2天，对于Lgr5单细胞需要培养6-7天。

7.根据权利要求6所述的利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，其特征在于，所述机械拉伸是以气体压力或伺服电机作为驱动元件的拉伸装置来实现单轴、双轴和周向拉伸。

8.根据权利要求1所述的利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，其特征在于，步骤S2中所述加入完全培养基，在类器官培养至刚刚形成隐窝时，还包括将完全培养基替换为不包含R-Spondinl的培养基，然后再继续执行所述对类器官开始进行机械拉伸，直至类器官培养成熟。

9.根据权利要求8所述的利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，其特征在于，所述不包含R-Spondinl的培养基包括：Advanced DMEM/F12，B27，GlutaMAX，N-acetylcystene，以及生长因子Noggin和EGF。

10.根据权利要求9所述的利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，其特征在于，

在步骤S1中所述细胞为人源的肠原代隐窝时，所述不包含R-Spondinl的培养基还需加入Gastrin，Nicotinamide，A83-01，prostaglandin E2和SB202190；或者

在步骤S1中所述细胞为通过酶解、分选得到的肠Lgr5-eGFP单细胞时，所述不包含R-Spondinl的培养基还包括小分子CHIR99021和valproic acid。

11.根据权利要求1所述的利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法，其特征在于，步骤S2中所述类器官培养成熟后，还包括：

收集机械拉伸加载条件下培养的类器官，以静态培养的类器官作为对照，对拉伸加载条件下培养的类器官的干性相关基因表达水平进行测定，对拉伸加载条件下培养的类器官的细胞增殖情况进行测定，以及对拉伸加载条件下培养的类器官的干性相关蛋白表达情况进行测定。