[发明专利]细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法

说明书

本发明公开了一种细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，包括：制备大肠杆菌体外转录pKK450‑DNA模板；以pKK3535质粒为模板，制备荧光分子信标M.B.；制备大肠杆菌体外转录体系，检测大肠杆菌转录抑制剂对体外转录抑制活性。与现有技术相比，本发明可以精确的检测细菌转录抑制剂的活性；另外，由于本发明中采用荧光酶标仪以及96孔板此类高效、快速的检测仪器，因此，可以高通量的检测大量待测样品，对转录抑制类药物的筛选有着重要的应用价值。在此方法基础上可以对抑菌物质的作用机制进行分析，以确定其对细菌转录的影响。

技术领域

本发明涉及抑制细菌转录技术领域，特别是一种细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法。

背景技术

随着全球细菌耐药性的日益严峻，很多细菌都已经产生了严重的耐药性，大量的上市抗生素失去抑菌效果。开发新的抗菌物质已迫在眉睫，抗菌肽、共生菌的次生代谢产物等天然产物是未来抗菌物质筛选的新方向。在大量的抗菌物质筛选过程中需要开发出经济、快速、高通量的活性检测方法来确定其抑菌作用机制，只有熟知其抗菌机制，才能安全合理有效的抑制及杀灭细菌。在众多抑菌物质中，抑制细菌RNA的转录是一种有效的抑菌机制。RNA转录抑制剂可作用于RNA聚合酶活性中心及其附近，阻止转录起始或者。RNA链的延伸从而阻止转录过程，严重的影响rRNA和mRNA的合成，从而造成细菌停止生长。如利福霉素类药物通过抑制转录的起始从而达到抑菌目的，该类药物是治疗结核病和布氏病的一线药物，随着利福霉素类药物耐药菌的出现，开发能杀灭利福霉素类药物耐药菌且生物利用度高的新型RNA聚合酶抑制剂已迫在眉睫。在细菌对数生长期，有一半以上的RNA聚合酶是在合成rRNA。因此以rRNA作为研究对象可以更加准确的反应细菌的转录水平。目前对转录水平的检测方法仍然局限于放射性同位素标记法，通过标记同位素到核酸上再进行定量研究。该方法因为涉及到放射性物质的使用，对于环境和实验人员有很大潜在危险。

因此，开发一种能够替代放射性同位素的检测方法是很要必要的。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，包括以下步骤：

步骤一、制备大肠杆菌体外转录pKK450-DNA模板；

步骤二、以pKK3535质粒为模板，制备荧光分子信标M.B.；

步骤三、制备大肠杆菌体外转录体系，体外转录反应组分如下表：

将体外转录组分按照每个反应200μL分别移入EP管中，置于37℃温度下进行孵育反应1小时，通过加入20μL的3M醋酸钠，3倍反应体积的100％乙醇和3μL糖原终止体外转录反应；-20℃静置1小时；4℃，12000rcf离心10min，弃上清，使用1mL的80％的冰冷乙醇冲洗沉淀；4℃，12000rcf离心10min，弃上清，待EP管干燥，RNA沉降于底部；每管各加18μL的荧光分子信标M.B.Buffer和2μL浓度为0.01μM的M.B.漩涡震荡后短暂离心，置于95℃变性2min后，45℃退火10min；

步骤四、检测大肠杆菌转录抑制剂对体外转录抑制活性：

在步骤三的体外转录反应EP管中加入大肠杆菌转录抑制剂2μL；然后将反应液移入黑色96孔酶标板内，使用荧光酶标仪读取荧光强度，激发波长为485nm，发射波长520nm。

进一步地，所述步骤一具体包括：