[发明专利]细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法

权利要求书

1.一种细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、制备大肠杆菌体外转录pKK450-DNA模板；

步骤二、以pKK3535质粒为模板，制备荧光分子信标M.B.；

步骤三、制备大肠杆菌体外转录体系，体外转录反应组分如下表：

将体外转录组分按照每个反应200μL分别移入EP管中，置于37℃温度下进行孵育反应1小时，通过加入20μL的3M醋酸钠，3倍反应体积的100％乙醇和3μL糖原终止体外转录反应；-20℃静置1小时；4℃，12000rcf离心10min，弃上清，使用1mL的80％的冰冷乙醇冲洗沉淀；4℃，12000rcf离心10min，弃上清，待EP管干燥，RNA沉降于底部；每管各加18μL的荧光分子信标M.B.Buffer和2μL浓度为0.01μM的M.B.漩涡震荡后短暂离心，置于95℃变性2min后，45℃退火10min；

步骤四、检测大肠杆菌转录抑制剂对体外转录抑制活性：

在步骤三的体外转录反应EP管中加入大肠杆菌转录抑制剂2μL；然后将反应液移入黑色96孔酶标板内，使用荧光酶标仪读取荧光强度，激发波长为485nm，发射波长520nm。

2.根据权利要求1所述的细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：

以含有大肠杆菌rrnB核糖体操纵子的全长以及启动序列的pKK3535质粒为模板，pKK-F与pKK-450R为引物，pKK-F引物的5’-3’端引物序列为：GGCAATGACGCCAGGAGCTG，pKK-450R引物的5’-3’端引物序列为：CCCCGCTGAAAGTACTTTACAACC；对目的片段进行PCR扩增，预混液反应体系：Pfu DNA聚合酶1μL，10x Buffer 10μL，dNTPs 8μL，上下游引物各4μL，pKK3535质粒10μL，ddH2O 71μL，反应条件：95℃3min，95℃30s，55℃30s，72℃60s，循环30次，72℃10min；使用PCR产物纯化试剂盒对扩增得到的DNA片段进行产物回收，获得大肠杆菌体外转录pKK450-DNA模板。

3.根据权利要求1所述的细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：

以pKK3535质粒为模板，设计并合成与rrnB操纵子前端可以互补结合的29个碱基构成的寡聚核苷酸，通过在寡聚核苷酸5’端连接FAM荧光基团、3’端连接Dabcyl淬灭基团并通过在其两端增加互补的重复GC的序列使之形成颈环状结构，使得FAM与Dabcyl相互靠近，在分子信标单独存在时荧光被淬灭；当分子信标能与大肠杆菌rRNA模板特异性的结合后CG序列会被分开，颈环结构发生改变；FAM基团远离Dabcyl基团，从而激发出荧光信号。

4.根据权利要求1所述的细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，其特征在于，所述步骤三中，荧光分子信标M.B.Buffer组分为：KCl 1M，MgCl₂ 10mM，pH＝8的Tris-HCl 100μM。