[发明专利]基于CRISPR-Cas12a传感系统的PPIs检测平台及检测方法

说明书

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas12a传感系统的PPIs检测平台及检测方法，用于p53‑MDM2相互作用监测和抑制剂疗效评价。所述检测方法包括如下步骤：对Cas‑PPIor进行探针设计及Cas‑PPIor可行性进行验证；Cas‑PPIor用于p53‑MDM2相互作用研究及抑制剂效力评价；Cas‑PPIor用于细胞内蛋白相互作用检测。本发明开发了基于CRISPR‑Cas12a传感系统的PPIs检测平台，可以实现有效的p53‑MDM2相互作用过程监测以及小分子拮抗剂的抑制作用效力评估。

技术领域

本发明属于纳米技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a传感系统的PPIs检测平台及检测方法，用于p53-MDM2相互作用监测和抑制剂效力评估。

背景技术

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）与癌细胞信号传导和存活息息相关，因此，针对致癌PPIs的小分子抑制剂的开发已成为一个热门话题。人类p53是研究最广泛的肿瘤抑制蛋白和转录因子之一，在调节增殖、细胞死亡和分化方面起着关键作用。在无压力条件下，p53与MDM2之间存在负反馈调控从而保持在低水平状态, p53可以激活MDM2的表达，进而阻断p53的转录活性，促进p53的降解。就大多数肿瘤而言，MDM2的过表达已被证明可阻断p53的功能并促进肿瘤进展。使用抑制剂破坏p53-MDM2的相互作用，可以激活p53从而抑制肿瘤生长。到目前为止，已经提出了各种策略用于p53研究和监测与 MDM2的相互作用，包括差示扫描量热法和荧光法在内的生物物理方法是PPIs 研究中广泛使用的技术，它们需要相对较高的蛋白质浓度和精致的实验环境。因此，需要开发灵敏度和适用性更强的p53-MDM2相互作用监测方法，以促进基础细胞机制的开发和靶向PPIs药物的发现。

p53作为一种转录因子，具有DNA结合结构域，能够结合共识位点dsDNA作为多结构域单体的同型四聚体。突变p53和MDM2结合后失去DNA结合能力，这种依赖于构象的结合能力为p53检测策略提供了新的见解。CRISPR-Cas系统不仅彻底改变了基因组编辑，而且由于其单碱基分辨率和等温信号放大的特点，开启了生物传感的新时代。Cas9、Cas12a、Cas13和Cas14在目标核酸的位点特异性结合后均具有非特异性反式切割活性。迄今为止，CRISPR-Cas12a系统已显示出在核酸相关诊断、基因组操作和DNA组装方面的巨大潜力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于CRISPR-Cas12a传感系统的PPIs检测平台及检测方法，用于p53-MDM2相互作用监测和抑制剂效力评估。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种基于CRISPR-Cas12a传感系统的PPIs检测平台，用于p53-MDM2相互作用监测和抑制剂疗效评价。

本发明还提供一种基于CRISPR-Cas12a传感系统的PPIs检测平台的构建方法，将PAM结构域整合到特定的p53 DNA结合结构域中，将蛋白质相互作用事件转换到Cas12a的反式裂解活性中。

本发明还提供一种利用基于CRISPR-Cas12a传感系统的PPIs检测平台的检测方法，包括如下步骤：

S1、设计Cas-PPIor探针dsDNA，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证p53与dsDNA的结合能力、p53和MDM2的结合能力以及Nutlin-3a对p53与MDM2结合的抑制效力，对Cas-PPIor可行性进行验证；