[发明专利]基于CRISPR-Cas12a传感系统的PPIs检测平台及检测方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas12a传感系统的PPIs检测平台，其特征在于，用于p53-MDM2相互作用监测和抑制剂疗效评价。

2.一种如权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a传感系统的PPIs检测平台的构建方法，其特征在于，将PAM结构域整合到特定的p53 DNA结合结构域中，将蛋白质相互作用事件转换到Cas12a的反式裂解活性中。

3.一种利用如权利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas12a传感系统的PPIs检测平台的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、设计Cas-PPIor探针dsDNA，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证p53与dsDNA的结合能力、p53和MDM2的结合能力以及Nutlin-3a对p53与MDM2结合的抑制效力，对Cas-PPIor可行性进行验证；

S2、Cas-PPIor用于p53-MDM2相互作用研究及抑制剂效力评价：Cas-PPIor用于检测不同浓度的p53-MDM2复合物，将p53的特异性DNA结合特性与Cas12a平台耦合，通过检测溶液中未结合p53的游离DNA, 对荧光数据进行拟合分析，从而得出p53-MDM2的K_D值；选择Nutlin-3a来评估在竞争性结合实验中对p53-MDM2 相互作用的抑制；

S3、Cas-PPIor用于细胞内蛋白相互作用检测：磁珠捕获细胞中p53然后与激活序列结合，Cas-PPIor检测体系里剩余的激活链，从而从荧光水平间接得出细胞中蛋白相互作用水平。

4.根据权利要求3所述的基于CRISPR-Cas12a传感系统的PPIs检测方法，其特征在于，步骤S1中，Cas12a/sgRNA复合物和p53以竞争方式结合相同的dsDNA 探针，借助抗体修饰的磁珠，使结合的dsDNA探针与p53一起分离。