[发明专利]适用于难治性血管新生性眼疾病基因治疗的慢病毒载体

说明书

本发明公开了一种适用于难治性血管新生性眼疾病基因治疗的慢病毒载体；其包装质粒包括表达包膜蛋白的pMD.2G、表达REV蛋白的pRSV‑REV、整合酶突变失活的pMDlg/pRRE‑IN mut和表达VEGFA抗体基因的载体质粒。该载体质粒是将抗VEGFA基因替换质粒pCCL‑PGK‑eGFP中的eGFP基因构建而得；该抗VEGFA基因是在雷珠单抗的重链和轻链可变区分别加上人源IgG的Fc片段恒定区CH₃，并对基因进行密码子优化而得。本发明提供的非整合型慢病毒载体感染细胞后，细胞可以长期稳定表达血管内皮生长因子VEGFA抗体，并且不会整合至人染色体组，避免了对基因组的影响。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种适用于难治性血管新生性眼疾病基因治疗的慢病毒载体；尤其涉及一种适用于难治性血管新生性眼疾病基因治疗的经改造的非整合型慢病毒载体系统。

背景技术

难治性血管新生性眼疾病是一组以脉络膜或视网膜血管新生为病理特征的疾病，包括血管新生性年龄相关性黄斑变性(nAMD)，糖尿病视网膜病变相关黄斑水肿(DME)及视网膜静脉阻塞相关黄斑水肿(RVO-ME)等。由于新生血管壁的结构异常，导致血管的渗漏和出血，进而引发一系列的继发性病理改变，疾病常累及视功能最为密切的黄斑区，引起黄斑区视网膜神经上皮下或神经上皮层间积液，进而导致明显的视力下降，最终使中心视力丧失。经过治疗后，患者仍可能出现纤维化和(或)RPE层萎缩的情况，导致严重的永久性中枢视力丧失。所以，难治性血管新生性眼疾病成为世界难治性眼盲的重要原因(Wong et al2016)，也是世界卫生组织重点防盲眼病。

目前，难治性血管新生性眼疾病的发病机制还未完全阐明，但是血管内皮生长因子(VEGF-A)是公认的能促进脉络膜新生血管的重要因子。VEGF-A因子是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。因此，现有治疗方法主要通过玻璃体腔注射VEGF-A因子的抗体药物，抑制VEGF-A因子，减弱其增生新的血管作用。抗血管内皮生长因子(Anti-VEGF)治疗是目前难治性血管新生性眼疾病的标准治疗方法。现有的药物主要包括雷珠单抗(Ranibizumab)，阿柏西普(Aflibercept)，康柏西普(Conbercept)。但目前现有的抗VEGF治疗方法通常需要较多的注射次数，根据患者情况每次注射相隔时间不确定，平均约4-8周需要进行一次注射。这对于患者和医生来说治疗负担较重。有些患者经历了抗VEGF治疗疲劳，选择停止治疗(Boulanger-Scemama et al 2015)，这可能会导致疾病复发和永久视力丧失(Essex et al 2016)。

近年来基因治疗技术逐步建立和完善。应用基因治疗的方法治疗难治性血管新生性眼疾病是实现一次注射，终身治疗目标的发展趋势。现在已有多家公司开展基因治疗难治性血管新生性眼疾病的药物研发，乃至进入临床试验阶段。其原理是通过视网膜下注射带有目标基因片段的病毒载体，可通过表达血管生成抑制因子，或增加RPE细胞分泌内源性抗VEGF抗体，长期有效控制眼内VEGF浓度在较低的水平，达到治疗血管新生性疾病的效果。

但是，临床上现有治疗方法存在以下问题：经济方面：抗体药物比较昂贵。治疗wAMD需要每4-8周就要进行一次抗体注射。除了药物本身带来的直接医疗费用，还有交通费、营养费等直接非医疗费用，甚至还有误工费等间接损失。副面影响方面：1)长期、频繁的玻璃体腔注射抗体药物引起眼部二次伤害；2)长期大量注射抗VEGF药物可能扩散全身，引起对机体其它器官或组织的VEGF抑制等问题。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中治疗难治性血管新生性眼疾病安全性与有效性问题，提供一种适用于难治性血管新生性眼疾病基因治疗的慢病毒载体；具体是一种适用于难治性血管新生性眼疾病基因治疗的非整合型慢病毒载体。