[发明专利]一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法

说明书

本发明公开了一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法。利用安全菌株谷氨酸棒杆菌过量表达海藻糖合酶并利用曲拉通X‑100处理重组谷氨酸棒杆菌获得透性化细胞，可使用全细胞催化麦芽糖合成海藻糖。在催化制备海藻糖的反应液中添加产葡萄糖酸黑曲霉AnM1菌体，将体系中的葡萄糖氧化成葡萄糖酸，可降低葡萄糖对海藻糖合酶活性的抑制作用，提高海藻糖合成速率。待海藻糖合成反应平衡，反应液离心收集谷氨酸棒杆菌和黑曲霉菌体，所得菌体可重复利用。所得反应液上清中添加糖化酶和黑曲霉AnM1菌体，将反应液中剩余麦芽糖水解成葡萄糖并氧化成葡萄糖酸，获得含海藻糖和葡萄糖酸的反应液。本发明可同时生产海藻糖和葡萄糖酸，并能提高原料利用率。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法。

背景技术

海藻糖是一种由α,α-1,1-糖苷键联结两分子葡萄糖组成的非还原性双糖，对生物大分子、细胞和生物体组织具有特异性保护作用。可用于保持细胞活性、提升食品品质、增强保湿类化妆品功能。因此，海藻糖在医药、食品和化妆品行业应用前景广阔。海藻糖合酶可催化麦芽糖合成海藻糖，工艺简单，工业化生产潜力较大。海藻糖合酶催化麦芽糖合成海藻糖为可逆反应，当反应体系中海藻糖积累到一定浓度比例反应达到平衡，海藻糖积累量不再增加，并残留一定浓度的底物麦芽糖。同时，海藻糖合酶催化麦芽糖合成海藻糖过程中会有副产物葡萄糖生成，而且葡萄糖能够抑制海藻糖合酶活性。如南宁中诺生物工程有限责任公司韦宇拓等报道来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的海藻糖合酶能够高效催化麦芽糖合成海藻糖，反应后剩余部分麦芽糖并生成一定比例的葡萄糖，同时指出葡萄糖对该海藻糖合酶具有较强的抑制作用。同样地，南宁中诺生物工程有限责任公司李晓明等报道葡萄糖能够显著抑制来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合酶活性，葡萄糖浓度为5g/l时就可将海藻糖转化率降低50％以上。将该海藻糖合酶进行定点突变可降低葡萄糖对海藻糖合成的抑制作用，利用突变酶制备海藻糖，反应后剩余部分麦芽糖并生成一定比例的葡萄糖。海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖过程中会残留部分麦芽糖并生成葡萄糖，海藻糖、麦芽糖和葡萄糖性质相似度较高，加大了海藻糖的分离纯化难度。

葡萄糖酸由葡萄糖氧化而来，广泛用于食品、医药、建筑等行业。在食品工业中葡萄糖酸可用作酸味剂、防腐剂、蛋白凝固剂、膨松剂等。葡萄糖酸与钙、锌等离子形成葡萄糖酸盐，可用作营养剂和药物。在建筑业中葡萄糖酸钠用作水泥掺和剂，可增加混凝土的可塑性和强度。目前，葡萄糖酸的主要生产方法有酶催化法和微生物发酵法。酶催化法是利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶双酶组合在有氧条件下催化葡萄糖氧化生产葡萄糖酸，该法存在酶成本较高的问题，目前工业化应用较少。微生物发酵法生产葡萄糖酸，是在微生物培养过程中菌体生长并合成葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，继而催化葡萄糖氧化生产葡萄糖酸。因此，培养要求低和产酶能力强的微生物菌株可用于生产葡萄糖酸。发明人通过筛选获得一株产葡萄糖酸的黑曲霉(Aspergillus niger)AnM1保藏编号为CCTCC M 20211310。该菌株具有较强的葡萄糖酸生产能力，并且发酵后收集的菌体可重复用于催化含葡萄糖的转化液生产葡萄糖酸。

针对海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖过程中葡萄糖的生成和抑制作用以及麦芽糖残留的问题，我们提供了一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法。

发明内容

本发明提供了一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法。利用安全菌株谷氨酸棒杆菌过量表达自身来源海藻糖合酶，重组谷氨酸棒杆菌破碎液能够高效利用麦芽糖合成海藻糖，或利用曲拉通X-100处理重组谷氨酸棒杆菌获得透性化细胞，可使用全细胞催化麦芽糖合成海藻糖。在催化制备海藻糖的反应液中添加产葡萄糖酸黑曲霉AnM1菌体，将体系中的葡萄糖氧化成葡萄糖酸，可降低葡萄糖对海藻糖合酶活性的抑制作用，提高海藻糖合成速率。待海藻糖合成反应平衡，反应液离心收集谷氨酸棒杆菌和黑曲霉菌体，所得菌体可重复利用。所得反应液上清中添加糖化酶和黑曲霉AnM1菌体，将反应液中剩余麦芽糖水解成葡萄糖并氧化成葡萄糖酸，获得含海藻糖和葡萄糖酸的反应液。