[发明专利]一种富集细胞表面介导tau蛋白扩散受体的方法

说明书

本发明提供了一种通过在微管相关蛋白tau上修饰biotin(生物素)从而实现发现介导tau内吞受体的新方法。本发明发现，tau蛋白能被小鼠海马神经元细胞HT22摄取。通过StreptAvidin‑Biotin富集后银染，观察到差异条带。进一步通过质谱鉴定到差异蛋白候选。本发明的研究成果为发现介导tau扩散的受体蛋白提供了有效的方法。

技术领域

本发明属于分子生物学和神经退行性疾病领域，更具体而言，本发明涉及探索神经退行性疾病发病机制领域。本发明提供了一种发现介导tau蛋白扩散受体(即介导tau蛋白内吞受体)的方法。

背景技术

阿尔茨海默症(AD)是最常见的神经退行性疾病，估计占全世界所有痴呆症病例的60-70％，给人类健康造成了严重的影响，降低了患者及家属的生活质量。如果仍没有有效治疗方法，将在2050年达到流行病水平(H.Wesseling,W.Mair,M.Kumar,C.N.Schlaffner,S.Tang,P.Beerepoot,B.Fatou et al.Tau PTM Profiles Identify PatientHeterogeneity and Stages of Alzheimer's Disease,Cell 183(6)(2020)1699-1713e13)。

AD典型的病理特征是神经元外淀粉样蛋白-β(Aβ)沉积、神经元内神经纤维缠结(NFTs)的形成以及神经炎症。近年来流行的淀粉样蛋白级联假说认为脑内Aβ沉积是AD的始发事件，但随着针对Aβ治疗的临床研究的失败，越来越多的证据表明该假说不足以解释AD发病机制(F.Leng,P.Edison,Neuroinflammation and microglial activation inAlzheimer disease:where do we go from here？,Nature Reviews Neurology 17(3)(2020)157-172.)。有研究表明，正常老年人脑内也存在Aβ斑块，这也使Aβ是否是致病原因成为悬念。

微管相关蛋白tau在生理条件下起到稳定微管的作用，但在病理条件下，过度磷酸化的tau蛋白从微管上脱落并自发形成聚集体，造成了神经毒性。近年来，针对tau蛋白的抗体药物研发逐步成为热点。在研究中发现，常见的神经退行性疾病中相关蛋白如tau、α-synuclein除了本身的毒性，还具有类似于朊蛋白的在细胞间扩散的性质。这导致疾病从一个很小的区域扩散至全脑，如tau最先发现在内嗅皮层，扩散至海马，最终到达大脑新皮层，导致全脑的萎缩。尽管针对以上致病原因的研究越来越多，但临床上仍未找到一个有效的治疗靶点，关于AD发病机制的研究仍是尚未攻克的难题。通过富集的方式发现神经元中介导tau蛋白扩散的受体还未见报道。本发明利用基于化学合成、分子生物学及基于质谱的定量蛋白质组学技术(如流式细胞术、激光共聚焦、银染、on beads酶解质谱鉴定)发现：1)通过流式细胞术分析，tau-FITC能被神经元细胞摄取；2)采用激光共聚焦，tau-FITC与神经元细胞有共定位；3)MALDI表征合成实验，发现偶联生物素后，tau蛋白峰型发生偏移，提示分子量的增加。4)银染发现相比于未加tau-biotin的对照组，tau-biotin孵育组有差异条带的增加。5)质谱鉴定on beads酶解样品，发现了一系列tau相互需用蛋白，对其进行鉴定，有部分膜蛋白被富集到。本发明首次发现tau-biotin作为一种诱饵，来抓取关键膜蛋白的作用；发现抓取的部分相互蛋白是未见报道的；因此，tau-biotin可以作为发现介导tau蛋白扩散受体的新方法。

发明内容

本发明的目的之一是发现介导tau蛋白扩散的受体。

本发明的目的之二是提供发现介导tau蛋白扩散受体的有效工具。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了tau-biotin的合成方法。

进一步，通过MALDI对合成产物进行表征。