[发明专利]一种酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法

说明书

本发明公开了一种酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，由GH3家族的β‑葡萄糖苷酶水解黄芪甲苷母核上C3位的β‑D‑糖苷键和C6位的β‑D‑糖苷键。本发明仅仅通过一种糖苷酶，就能高效地将黄芪甲苷几乎完全转化制备得到环黄芪醇，步骤简便，从而有效降低了生产成本。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及到一种酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。

背景技术

环黄芪醇是现今唯一发现的端粒酶激活剂，通过增加端粒酶从而延缓端粒变短，环黄芪醇被认为具有抗衰老的作用。进一步的研究表明，环黄芪醇具有保肝、护肝以及促进肝损伤修复的作用。

环黄芪醇是黄芪甲苷及多数黄芪皂苷的苷元。环黄芪醇的制备原理为断开黄芪甲苷C3位木糖和C6位葡萄糖上的糖苷键。目前，环黄芪醇主要以黄芪甲苷为原料进行制备，方法主要有酸水解法、Smith降解法和酶催化水解法。

酸水解法制备环黄芪醇操作简单，但环黄芪醇在酸性条件下不稳定容易转化为黄芪醇，影响产品的得率；Smith降解法条件温和，反应较为专一，但反应过程中需要较多的有机溶剂，对环境带来不利影响。利用酶法制备环黄芪醇，不仅条件温和、反应高效，且成本低、污染少，适宜规模化生产制备。

已公开的中国专利中，均使用两种及两种以上的商品酶和/或重组酶组成复合酶水解黄芪甲苷制备环黄芪醇。其中专利CN105734109A中的复合酶为β-葡萄糖苷酶、蜗牛酶、柚苷酶、纤维素酶等酶按不同质量比的形式混合得来；专利CN 105566434A中的复合酶为β-葡萄糖苷酶、柚苷酶、β-木糖苷酶的组合；

专利CN107058445A中的复合酶为纤维素酶和来源于Phycicoccus sp.Soil748的重组β-葡萄糖苷酶。相较于本发明来说，采用复合酶需要按顺序加入不同的酶，不仅步骤繁琐，且增加了生产成本。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的不足，本发明的其中一个目的是提供一种酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，仅仅通过一种糖苷酶，就能高效地将黄芪甲苷几乎完全转化制备得到环黄芪醇，步骤简便，从而有效降低了生产成本。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，由GH3家族的β-葡萄糖苷酶水解黄芪甲苷母核上C3位的β-D-糖苷键和C6位的β-D-糖苷键。

作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：所述GH3家族的β-葡萄糖苷酶来源于Dictyoglomus turgidum DSM 6724，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：所述GH3家族的β-葡萄糖苷酶由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列通过重组大肠杆菌表达获得。

作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：所述GH3家族的β-葡萄糖苷酶以纯化后的β-葡萄糖苷酶添加，体系中酶添加量为10～20U/mL。

作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：所述纯化后的β-葡萄糖苷酶，将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列插入表达载体后导入至大肠杆菌，30℃诱导表达，离心收集菌体，超声破碎并离心，上清液为重组酶粗酶液，将重组酶粗酶液纯化。

作为本发明酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法的一种优选方案，其中：所述GH3家族的β-葡萄糖苷酶以含有β-葡萄糖苷酶的细胞催化剂添加，体系中细胞催化剂的添加量为10～30g/L。