[发明专利]甲基化检测组合物、试剂盒及方法

说明书

本发明涉及甲基化检测组合物、试剂盒及方法。具体地，本发明提供用于核酸扩增的寡核苷酸接头和捕获寡核苷酸及其使用方法和用途，所述寡核苷酸接头包含第一结合序列和第二结合序列，所述第一结合序列包含与捕获寡核苷酸的3’末端序列相同的序列，所述第二结合序列与靶标分子互补，所述捕获寡核苷酸包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列。本发明产品和方法可实现特异性好、灵敏度高的DNA甲基化检测。

技术领域

本发明涉及甲基化检测组合物、试剂盒及方法。

背景技术

血浆中含有游离DNA(cfDNA)。相比于组织活检，血浆样本可多次取样、无侵入性。然而，cfDNA在体液中的含量极少，健康人血浆cfDNA含量仅约5-10ng/ml。因此，cfDNA甲基化检测最大的技术难点在于如何利用微量的cfDNA样本对极少量的甲基化异常基因进行检测。

目前，基于重亚硫酸盐转化的方法是cfDNA甲基化检测的主流选择。其原理为重亚硫酸盐处理DNA，胞嘧啶会脱氨基转变成尿嘧啶，5甲基胞嘧啶由于其携带的甲基基团抑制了重亚硫酸盐的作用而保持原来的序列不变，本质在于利用重亚硫酸盐处理使胞嘧啶上修饰基团的不同转变成碱基序列的不同，后续可通过甲基化特异性PCR、甲基化芯片或测序来检测cfDNA甲基化位点。

基于重亚硫酸盐转化的方法存在许多不足：1、重亚硫酸盐转化的DNA样本需要经受严苛的化学处理过程，例如低pH、高温、高浓度的重亚硫酸盐等，这些条件会导致DNA大量降解，降解高达90％，模板完整性降低，因此所需的cfDNA起始用量较大；2、重亚硫酸盐处理不彻底会导致未甲基化的胞嘧啶转化不完全，出现假阳性的结果，从而对DNA甲基化情况产生错误的评估；3、未甲基化的胞嘧啶约占人基因组总胞嘧啶数的95％，将未甲基化的胞嘧啶全部转换为尿嘧啶则会严重降低序列复杂性，在对多种靶标分子进行同时检测时，引物设计更困难，可能导致检测准确性降低，以及增加检测成本；4、重亚硫酸盐转化处理时间长、后续需要反复洗涤纯化、操作繁琐，耗费大量的人力和时间。

本领域需要一种无需重亚硫酸盐转化、无需大量起始样本、操作简单快捷、特异性好、灵敏度高的甲基化检测体系和方法，实现对微量cfDNA的甲基化检测。

发明内容

发明人开发了一种利用位点特异性切割核酸酶和基于通用引物扩增的核酸检测体系，可对微量cfDNA进行甲基化检测，具有无需重亚硫酸盐转化、所需起始样本量少、操作简单快捷、特异性好、灵敏度高的优点。

本发明第一方面提供一种用于核酸扩增的寡核苷酸接头，从5’到3’包含第一结合序列和第二结合序列，所述第一结合序列包含与捕获寡核苷酸的3’末端序列至少部分相同的序列，所述第二结合序列与靶标分子互补。

优选地，所述寡核苷酸接头还包括核酸延伸阻断修饰。

在一个或多个实施方案中，所述核酸延伸阻断修饰位于第二结合序列的3’端。

在一个或多个实施方案中，所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种：Spacer、硫代基团、巯基、氨基或尿嘧啶碱基。

在一个或多个实施方案中，所述第二结合序列与靶标分子的非5’末端序列互补。

在一个或多个实施方案中，所述第二结合序列与靶标分子的3’末端序列互补。

在一个或多个实施方案中，所述第二结合序列可具有核酸类似物修饰；优选地，所述核酸类似物包括选自以下的一种或多种：肽核酸、锁核酸、2'-O，4'-C-甲基化架桥RNA、2'-甲氧基修饰碱基、2'-O-甲基RNA、脱氧尿嘧啶核苷或2'-氟代RNA。

在一个或多个实施方案中，所述靶标分子是3’端和5’端序列明确的靶标分子。优选地，所述靶标分子是位点特异性切割核酸酶的酶切产物，例如是两端均因位点特异性切割核酸酶酶切而具有明确序列的靶标分子。