[发明专利]固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法

说明书

本申请涉及一种固相富集O‑GlcNAc糖肽的制备方法，其包括以下步骤：S1、提供多肽混合物和固相材料，多肽混合物包括无聚糖多肽、N‑聚糖多肽、粘蛋白型O‑糖肽和O‑GlcNAc糖肽；S21、氧化多肽混合物并通过共价结合到固相材料上，去除N‑聚糖后得到固相结合的O‑糖肽和O‑GlcNAc糖肽；或者，S22、去除多肽混合物的N‑聚糖后，将多肽混合物通过亲和结合在固相材料上，得到固相结合的O‑糖肽和O‑GlcNAc糖肽；以及，S3、进一步酶切或水解得到O‑GlcNAc糖肽。该方法所制得的O‑糖肽的富集O‑GlcNAc糖肽和位点特异性均处于较高水平，以解决现有技术中制备的O‑糖肽中富集O‑GlcNAc糖肽和位点特异性低的难题。

技术领域

本发明涉及一种固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，属于生物分子制备与分析技术领域。

背景技术

O-GlcNAcylation是一种营养和应激反应性翻译后修饰(PTM)，涉及将O-N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)连接到细胞质、细胞核和线粒体蛋白的Ser和Thr残基。添加和去除O-GlcNAc的一对酶即O-GlcNAc转移酶(OGT)和O-GlcNAcase(O-GlcNA糖苷酶，OGA)控制该PTM的动态循环。O-GlcNAcylation参与多种细胞过程的时空调节，包括转录、表观遗传修饰和细胞信号动力学。O-GlcNAcylation是高度动态的，通常是短暂的，但O-GlcNAcylation信号时间控制的潜在机制在很大程度上是未知的。O-GlcNAcylation可被视为细胞必不可少的“油脂和胶水”：充当“油脂”，通过涂覆目标蛋白(折叠或未折叠、成熟或新的)并防止不需要的蛋白质聚集或修饰。同时还充当“胶水”，通过响应内部和外部线索在时间和空间上调节蛋白质-蛋白质相互作用，从而影响细胞中各种蛋白质的功能。

总体O-GlcNAcylation增加成为癌细胞的一个共同特征。最近的研究表明，O-GlcNAcylation是营养状态的中心传播者，可以控制调节多种癌细胞表型的关键信号转导和代谢途径。此外EMT-HBP在提高蛋白O-GlcNAcylation水平方面发挥作用，加速KRAS突变诱导的肺肿瘤的发生和进展。研究O-GlcNAcylation的常用方法是通过抗体测定或点击化学来实现。然而这些方法缺乏特异性，因此建立一种能够鉴定O-GlcNAc底物的新技术，用于研究O-GlcNAc蛋白在癌症中的功能显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，以解决现有技术中制备的O-糖肽中富集O-GlcNAc糖肽和位点特异性低的难题。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，其包括以下步骤：

S1、提供多肽混合物和固相材料，所述多肽混合物包括无聚糖多肽、N-聚糖多肽、粘蛋白型O-糖肽和O-GlcNAc糖肽；

S21、氧化所述多肽混合物并通过共价结合到所述固相材料上，去除N-聚糖后得到固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽；

或者，

S22、去除所述多肽混合物的N-聚糖后，将所述多肽混合物通过亲和结合在所述固相材料上，得到固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽；

以及，

S3、进一步酶切或水解得到O-GlcNAc糖肽。

进一步地，所述氧化所述多肽混合物并通过共价结合到所述固相材料上，去除N-聚糖后得到固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽，包括：

通过氧化剂将所述多肽混合物中糖肽上的聚糖氧化成具有醛基的氧化糖肽，提取所述氧化糖肽，将其与表面具有酰肼或氨基的固相材料共价结合；

向混合物中加入N-糖苷酶将固相上的N-聚糖酶解，得到固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽。