[发明专利]固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法

权利要求书

1.一种固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提供多肽混合物和固相材料，所述多肽混合物包括无聚糖多肽、N-聚糖多肽、粘蛋白型O-糖肽和O-GlcNAc糖肽；

S21、氧化所述多肽混合物并通过共价结合到所述固相材料上，去除N-聚糖后得到固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽；

或者，

S22、去除所述多肽混合物的N-聚糖后，将所述多肽混合物通过亲和结合在所述固相材料上，得到固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽；

以及，

S3、进一步酶切或水解得到O-GlcNAc糖肽。

2.如权利要求1所述的固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，其特征在于，所述氧化多肽混合物并通过共价结合到所述固相材料上，去除N-聚糖后得到固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽，包括：

通过氧化剂将所述多肽混合物中糖肽上的聚糖氧化成具有醛基的氧化糖肽，提取所述氧化糖肽，将其与表面具有酰肼或胺基的固相材料共价结合；

向混合物中加入N-糖苷酶将固相上的N-聚糖酶解，得到固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽。

3.如权利要求1所述的固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，其特征在于，去除所述多肽混合物的N-聚糖后，将所述多肽混合物通过亲和结合在所述固相材料上，得到固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽，包括：

向所述多肽混合物中加入N-糖苷酶，酶切去除N-聚糖，得到含有无聚糖多肽、粘蛋白型O-糖肽、O-GlcNAc糖肽和N-聚糖的混合溶液，再通过纯化去除N-聚糖得到样本溶液；

将所述样本溶液溶于凝集素缓冲液中并加入到凝集素树脂中，具有O-GlcNAc结构的O-糖肽与所述凝集素树脂亲和结合得到固相结合的O-GlcNAc糖肽。

4.如权利要求2或3所述的固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，其特征在于，所述S3包括：

向所述固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽中加入O-GlcNAc糖苷酶，将所述O-GlcNAc糖肽从丝氨酸或苏氨酸酶解，收集上清液并纯化得到具有O-GlcNAc位点的去O-GlcNAc多肽。

5.如权利要求2所述的固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，其特征在于，所述S3包括：

向所述固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽中加入酸性溶液，使所述O-GlcNAc糖肽与丝氨酸或苏氨酸形成的腙键水解，收集上清液得到具有O-GlcNAc位点和氧化O-GlcNAc的O-糖肽。

6.如权利要求5所述的固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，其特征在于，所述向所述固相结合的O-GlcNAc糖肽中加入酸性溶液，还包括使加入酸性溶液后的混合液的pH小于3。

7.如权利要求1所述的固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，其特征在于，所述固相材料为树脂。

8.如权利要求1所述的固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，其特征在于，所述S3包括：

向所述固相结合的O-糖肽和O-GlcNAc糖肽加入溶于重水配制的MES(2-吗啉乙磺酸)的O-GlcNAc糖苷酶，酶解O-GlcNAc糖肽，并通过生物信息学方法对成分进行分析。

9.如权利要求1所述的固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，其特征在于，所述多肽混合物来源于组织细胞，所述组织细胞为良性和/或癌症组织细胞。

10.如权利要求9所述的固相富集O-GlcNAc糖肽的制备方法，其特征在于，还包括：

S0、分别取5-10毫克良性和癌症组织，将组织冷冻后用组织均质仪打碎，在打碎的组织中加入裂解液和蛋白质酶解抑制剂。