[发明专利]用于检测多粘菌素的荧光偏振免疫分析方法

说明书

本发明提供一种用于检测多粘菌素的荧光偏振免疫分析方法。所述方法包括：1)配制不同浓度的多粘菌素标准品溶液，将多粘菌素标准品溶液分别与荧光标记物溶液和多粘菌素单克隆抗体溶液混合孵育，进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；以测定的荧光偏振值为纵坐标，多粘菌素标准品溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线；以待测样品代替步骤1)中的多粘菌素标准品，按照步骤1)中的方法，测定待测样品的荧光偏振值，根据步骤1)中的标准曲线，计算出待测样品中多粘菌素的浓度。本发明提供的多粘菌素荧光偏振免疫分析技术是一种无需分离和洗涤的均相免疫方法，具有高通量、便捷和可靠等优点。

技术领域

本发明涉及免疫分析技术和兽药残留检测技术领域，具体地说，涉及一种用于检测多粘菌素的荧光偏振免疫分析方法。

背景技术

多黏菌素B(Polymyxin B，PMB)和粘菌素(colistin or Polymyxin E，PME)是从多黏芽孢杆菌中分离获得的一类阳离子多肽类抗生素。发现于20世纪50年代，并被应用于临床，之后因为毒副作用被其他抗生素取代。但是为了应对革兰氏阴性多重耐药菌感染，大约于2000年被重新用于人医临床。在畜牧兽医领域，粘菌素作为饲料添加的促生长剂一直广泛应用，但是在2016年，中国禁止了多粘菌素作为饲料添加剂使用，但允许作为治疗药物使用。

人医临床上，多粘菌素的治疗窗口狭窄，人体差异大，为了满足个性化治疗，需要一种精确、快速的检测方法。其次在畜牧兽医领域，GB31650-2019中明确规定了动物组织中粘菌素的残留限量，其中牛奶和羊奶残留限量为50μg/kg。因此也需要对多粘菌素B和粘菌素进行快速有效地检测。

目前，多粘菌素B和粘菌素的检测手段主要为液相色谱、液质联用色谱方法，但由于大型仪器价格昂贵、对操作人员要求高，检测时间长等问题，严重限制了对于多粘菌素B和粘菌素使用的有效监管。

而基于抗原-抗体特异性反应的免疫分析技术，具有速度快、操作性强、成本低的优点。其中荧光偏振免疫分析法是一种均相免疫分析方法，无需洗涤步骤，具有操作简单、速度快和等优点。因此开发一种简单、快捷、用于检测多粘菌素B和粘菌素的荧光偏振免疫分析方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测多粘菌素的荧光偏振免疫分析方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的用于检测多粘菌素的荧光偏振免疫分析方法，包括以下步骤：

1)配制不同浓度的多粘菌素标准品溶液，将多粘菌素标准品溶液分别与荧光标记物溶液和多粘菌素特异性抗体溶液混合孵育，进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；以测定的荧光偏振值为纵坐标，多粘菌素标准品溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线；

2)以待测样品代替步骤1)中的多粘菌素标准品，按照步骤1)中的方法，将所述待测样品与所述荧光标记物溶液和所述多粘菌素特异性抗体溶液混合孵育，进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值，根据步骤1)中的标准曲线，计算出所述待测样品中多粘菌素的浓度。

所述荧光标记物为Hapten-M-FITC、Hapten-2NM-FITC、Hapten-4NM-FITC、Hapten-6NM-FITC、Hapten-SMCC-FITC、Hapten-2NM-CY5、Hapten-4NM-CY5、Hapten-6NM-CY5、Hapten-SMCC-CY5、Hapten-FITC、PMB-FITC或PME-FITC，它们的结构分别如下：