[发明专利]用于检测多粘菌素的荧光偏振免疫分析方法

权利要求书

1.用于检测多粘菌素的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)配制不同浓度的多粘菌素标准品溶液，将多粘菌素标准品溶液分别与荧光标记物溶液和多粘菌素特异性抗体溶液混合孵育，进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；以测定的荧光偏振值为纵坐标，多粘菌素标准品溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线；

2)以待测样品代替步骤1)中的多粘菌素标准品，按照步骤1)中的方法，将所述待测样品与所述荧光标记物溶液和所述多粘菌素特异性抗体溶液混合孵育，进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值，根据步骤1)中的标准曲线，计算出所述待测样品中多粘菌素的浓度；

所述荧光标记物为Hapten-M-FITC、Hapten-2NM-FITC、Hapten-4NM-FITC、Hapten-6NM-FITC、Hapten-SMCC-FITC、Hapten-2NM-CY5、Hapten-4NM-CY5、Hapten-6NM-CY5、Hapten-SMCC-CY5、Hapten-FITC、PMB-FITC或PME-FITC，它们的结构分别如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记物为Hapten-2NM-FITC，其制备方法如下：

S1、将1.0-2.0mg FITC和0.64mg N-(2-氨乙基)-马来酰亚胺加入到400μL DMF中振荡至溶解，然后加入45-55μL三乙胺，室温避光反应1天；

S2、将2mg Hapten加入到200μL DMF中振荡至溶解，加入S1的反应液中，室温避光反应1天；取50uL反应液用薄层色谱法分离，展开剂为甲醇；从硅胶板上刮下R＝0.2的黄色条带，用甲醇水溶液洗脱，即为Hapten-2NM-FITC；

其中，Hapten的结构如式I所示：

所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1:0.5-1:2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多粘菌素特异性抗体为多克隆抗体，是以Hapten-KLH为免疫原，免疫新西兰大白兔动物，采集血清作为多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中用45-55mmo1/L、pH值8.0-8.5的硼酸盐缓冲液配制多粘菌素标准品溶液；

所配制的多粘菌素标准品溶液的浓度分别为2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL、0.64ng/mL和0.128ng/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记物溶液的工作浓度为10nM，所述多粘菌素特异性抗体溶液的工作浓度为8μg/mL；

所述多粘菌素标准品溶液、所述荧光标记物溶液和所述多粘菌素特异性抗体溶液以等体积比混合。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，竞争反应的条件为：20-25℃反应1-5min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光偏振值的测定条件为：当所述荧光标记物为Hapten-M-FITC、Hapten-2NM-FITC、Hapten-4NM-FITC、Hapten-6NM-FITC、Hapten-SMCC-FITC、Hapten-FITC、PMB-FITC或PME-FITC时，激发波长为480nm，发射波长为530nm；

当所述荧光标记物为Hapten-2NM-CY5、Hapten-4NM-CY5、Hapten-6NM-CY5或Hapten-SMCC-CY5时，激发波长为620nm，发射波长为685nm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中根据OriginPro 8.0软件中的四参数方程绘制标准曲线。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多粘菌素包括多粘菌素B、粘菌素。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品为动物性食品或血液。