[发明专利]一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法

说明书

本发明公开了一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，具体包括以下步骤：步骤1，由CVB5基因组扩增获得P1与3CD基因片段，3CD基因5’端和3’端分别带有Xho I和Sph I酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast‑Bac Dual载体的p10启动子下游，构建获得pFast‑BacDual‑3CD；步骤2，P1基因5’端和3’端分别带有Not I和Xba I酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast‑Bac Dual‑3CD质粒，制备得到质粒pFast‑Bac Dual‑3CD‑P1；步骤3，利用构建融合CVB5的3CD和P1蛋白序列的穿梭表达载体转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，获得阳性克隆，提取重组杆状病毒基因组DNA。本发明的CVB5的融合有外源肽段的3CD蛋白切割P1蛋白形成VLP，进而自组成大小均一的CVB5类病毒样颗粒。

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，尤其涉及一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法。

背景技术

手足口病(Hand-Foot-and-Mouth Disease,HFMD)是由多种肠道病毒感染引起的儿童急性传染病。多数幼儿患者发病突然，以发热和手足、口腔等部位皮疹、疱疹、溃疡为主要症状，少数患儿可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性痹、神经源性肺水肿和心肌炎严重并发症，个别重症患儿病情进展迅速，可导致死亡。近年来全球各地出现了爆发和流行，重症率和死亡率都直线上升，对幼儿健康造成严重威胁，且造成巨大的经济损失。HFMD的病原体为小核糖核酸病毒科，主要包括肠道病毒71型、柯萨奇病毒A群和B群以及埃可病毒等。近些年越来越多研究证据显示，柯萨奇病毒B组5型(简称CVB5)是手足口病的重要病原体之一。

CVB5为无包膜的单股正链RNA病毒，病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，直径24-30nm。CVB5基因组全长约7,400bp，由一个开放阅读框及两个非翻译区。CVB5基因组开放阅读框可编码2,194个氨基酸的多聚蛋白前体，被病毒自身编码的蛋白酶进一步水解为三个前体蛋白(P1、P2、P3)。P1前体蛋白基因编码四种结构蛋白—VP1、VP2、VP3和VP4，其中，VP1、VP2和VP3三个多肽呈现在病毒衣壳的表面，中和抗体主要针对VP1产生作用；VP4与病毒核心紧密相连，包埋在病毒内侧。P2和P3基因区编码七种非结构蛋白—2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D，其中3CD蛋白酶的主要作用是对P1进行切割并组装成病毒的衣壳。VLP是由病毒外壳蛋白质所组成的不含遗传物质的壳状结构。由于其没有病毒的核酸，不能自主复制，且与其他抗原成分相比，更接近天然构象，能够更有效地引起机体产生免疫反应，为疫苗研究提供了新思路。

杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，其基因组大小为80-180kb，在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。杆状病毒区别于其他病毒的一个特点是其具有两种不同的病毒粒子形态：一种为出芽型的病毒粒子(budded virus,BV)，主要介导细胞与细胞之间的系统感染，入侵细胞是通过受体介导的内吞作用；另一种为包埋型的病毒粒子(Occlusion-derivedvirus,ODV)，在病毒的口服感染过程中，节肢动物肠道碱性环境使包埋型的病毒粒子外壳脱落，萌发成具有侵染能力的病毒并感染肠道细胞达到病毒传播。E.coli-昆虫细胞穿梭载体(Bacmid)是最为方便的重组杆状病毒筛选系统。Bacmid既能在E.coli中复制，也能感染昆虫细胞。重组Bacmid转染昆虫细胞，包装出重组杆状病毒,同时表达外源基因。

发明内容

(一)发明目的

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，通过融合CVB5的外源肽段的P1蛋白和3CD蛋白酶，能够获得高纯度、形态均一的类病毒样颗粒，用于手足口疫苗的制备。

(二)技术方案

为达到上述技术目的：