[发明专利]一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法

权利要求书

1.一种表达CVB5类病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体，其特征在于，其含有分别受polyhedrin启动子调控的P1蛋白表达序列和受p10启动子调控的非结构蛋白表达序列。

2.根据权利要求1所述的一种表达CVB5类病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述非结构蛋白表达序列为3CD蛋白表达序列。

3.根据权利要求1或2所述的一种表达CVB5类病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述CVB5类病毒样颗粒是融合CVB5外源肽段的P1蛋白与3CD蛋白的穿梭表达载体。

4.一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤1，由CVB5基因RNA反转录和PCR扩增，获得P1与3CD基因片段，3CD基因5’端和3’端分别带有Xho I和Sph I酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的p10启动子下游，构建获得pFast-Bac Dual-3CD；

步骤2，P1基因5’端和3’端分别带有Not I和Xba I酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual-3CD质粒，制备得到质粒pFast-BacDual-3CD-P1。

5.根据权利要求4所述的一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：

步骤3，利用构建的融合CVB5的3CD和P1蛋白序列的穿梭表达载体转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，获得阳性克隆，提取重组杆状病毒基因组DNA；

步骤4，将上述步骤3制备的重组杆状病毒基因组DNA转染昆虫细胞sf9，收获细胞培养上清，保存第一代病毒液。

步骤5，将上述步骤4获得的第一代病毒液感染昆虫细胞sf9，以此类推，得到高滴度的第六代病毒液。

6.根据权利要求4所述的一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述转染细胞为昆虫草地贪夜蛾sf9细胞，sf9细胞大小均一，方便操作，且对杆状病毒敏感，通常作为昆虫表达细胞，易于产生高水平蛋白表达量。

7.根据权利要求5所述的一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，将融合有外源片段的3CD蛋白酶切割P1蛋白形成VLP。