[发明专利]一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法和应用。本发明利用新兴的单碱基编辑技术，将SURE基因组中的Kanamycin抗性进行有效敲除，构建无Kanamycin抗性的SURE菌株用于后续的感受态制备以及AAV相关质粒构建，降低了ITR丢失频率，解决了目前AAV载体和SURE菌株由于具备相同Kan抗性标签而无法使用的问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种敲除Kan抗性基因的 SURE菌株及其构建方法和应用。

背景技术

作为基因治疗新兴的明星载体，腺相关病毒(AAV)载体备受关注，其基因组两端的两个反向末端重复序列(ITR)是AAV包装复制必须的结构，但是ITR非常容易丢失从而影响病毒颗粒的包装和感染力。研究表明，ITR序列的不同区段缺失，都会对rAAV的生产造成影响。特别是在产业化生产过程中，大规模发酵时产生的ITR序列的部分或完全缺失，将造成AAV产量的严重下降。AAV载体质粒构建过程中，提高ITR稳定性愈发重要。

SURE菌种是K-12系大肠杆菌，菌株体内重组酶系统整条通路被破坏，从而利用SURE菌株制备的感受态细胞在克隆实验中提高了外源甲基化DNA 的克隆效率，增强外源DNA的稳定性；解决真核生物DNA存在较多“十字型”、“Z字型”等二级或三级结构导致的克隆问题，可进行蓝白斑筛选。此菌种可以抑制无用处的DNA重排，故专门用来克隆那些在常规菌种不稳定的DNA片段，如重复DNA片段、Z-DNA、超长质粒和其他不稳定片段，针对AAV相关质粒构建，防止ITR丢失有非常好的效果。

SURE菌株自身携带Kanamycin抗性，同时临床使用的AAV质粒同样需要使用Kanamycin抗性，导致临床使用的质粒无法利用SURE感受态进行构建、扩繁，而目前尚未有有效的构建方法来构建能够有效敲除Kan抗性基因的SURE菌株，从而限制了AAV载体质粒产业化应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法，是的所述构建方法能够有效敲除SURE菌株Kan抗性基因，用于后续的感受态制备以及AAV相关质粒构建，降低ITR丢失频率；

本发明的另外一个目的在于提供上述菌株及其构建方法在AAV质粒构建或疫苗制备中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株，由单碱基编辑系统敲除SURE基因组中的Kanamycin抗性基因。

单碱基基因编辑技术，又称不依赖于DNA链断裂的基因编辑技术； dCas9-PmCDA1-UGI和Cas9n-PmCDA1-UGI单碱基编辑系统是基于七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶PmCDA1开发的两种单碱基编辑系统，PmCDA1能催化C脱氨基变成U，而U在DNA复制过程中会被识别成T，尿嘧啶糖基化酶抑制剂 UGI能防止尿嘧啶糖基化酶将U糖基化引起碱基切除修复。利用sgRNA将Cas9-胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶糖基化酶抑制子三者构成的融合蛋白靶向于 gRNA(sgRNA中与目标DNA互补配对的序列)互补配对的靶位点，并将该靶位点的胞嘧啶(C)的氨基去除，从而使得C变成尿嘧啶(U)，随着DNA的复制， U又会被胸腺嘧啶(T)替代，最终实现单碱基C→T的精确、高效突变。

在本发明具体实施方式中，所述单碱基编辑器系统为基于 dCas9-PmCDA1-UGI的单基因编辑器系统，可通过将各基因原件可被承载在市售载体上使用；dCas9、PmCDA1、UGI序列来自Addgene质粒 pScI_dCas9-CDA-UL，质粒编号：108551。

在本发明具体实施方式中，所述单碱基编辑器系统的gRNA序列为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列：CGAGCGAGCACGUACUCGGA 和/或GAACAAGAUGGAUUGCACGC。