[发明专利]一种带有可视化筛选标记的保加利亚黄皮尖椒遗传转化方法

说明书

本发明是一种在自然光下肉眼可视的带筛选标记的保加利亚黄皮尖椒的遗传转化方法，其特征在于：采用保加利亚黄皮尖椒无性系种子萌发的无菌苗子叶，用带有肉眼可见的红色蛋白报告基因RUBY的农杆菌对保加利亚黄皮尖椒无性系种子萌发的无菌苗子叶为外植体经愈伤组织培养的转化，再经不定芽分化、不定芽伸长以及再生苗生根培养、移栽，可以得到自然光下裸眼可见的红色蛋白报告基因RUBY的再生植株。采用本方法得到的带红色蛋白报告基因RUBY的稳定再生植株，为后续对保加利亚黄皮尖椒的基因育种奠定一定的基础，为植物基因组定点编辑技术在植物改良中的高效利用提供借鉴和参考，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明为一种带有自然光下可见的筛选标记的保加利亚黄皮尖椒的遗传转化方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

辣椒源于拉丁美洲,为茄科中的一种重要农作物,在世界范围广泛栽培，在亚热带和温带地区种植最广，我国辣椒种植面积约2250 万亩，占世界辣椒种植总面积的35％，主要分布在海南、广东、延庆、张家口、甘肃、湖南、河南等地。辣椒营养价值高，富含维生素A、B、C、D、E以及多种矿质元素如钼、锰、钾等。由于辣椒富含辣椒碱，使辣椒具有刺激性与药用价值；从辣椒中提取出的辣椒碱在治疗腰椎痛，神经痛，风湿痛以及过敏性鼻炎等症状中有明显作用。通过建立高效稳定的辣椒遗传转化体系，

关于辣椒遗传转化的研究有很多，Liu等用根瘤农杆菌进行遗传转化，转化外植体上长出芽，但不能诱导芽伸长，未能获得转基因植株。如叶志彪等将子叶和农杆菌共培养，再诱导出芽和芽伸长，转入含卡那霉素的生根培养基，获得含有目的基因的转化植株。Murphy 等在建立辣椒原生质体再生植株的基础上，用电激法介导原生质体转化Peppermottle potyvirus(辣椒斑驳病毒)和CMV病毒外壳蛋白基因﹐在Numex Rn aky等五个辣椒品种上成功转化﹔有部分研究者通过“伤口浸染”的方式对辣椒遗传转化技术做了深入研究。

其中，农杆菌介导的遗传转化是植物转基因强有力的生物技术工具。农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和 Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。由于其对仪器和操作技术要求较低，被广泛应用于植物基因工程中，用于研究未知基因功能、各种基因调控原件的机理等。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

RUBY系统是一种可以从产生的红色推断出特定基因的表达情况的全新系统，其特点是可以在可见光下直接观察到表达产物。该系统以甜菜红素作为报告分子，使用酪氨酸为底物将催化甜菜红素合成的三种酶的基因CYP76AD1、DODA、GT偶联到一个开放阅读框中，组成报告系统RUBY。该系统使用时不用进行特别的处理，有效规避了无菌材料被污染的风险，也不用依赖专用设备或昂贵的耗材，并且能避免因为取样时的机械外力刺激使相关基因的表达模式受到干扰。

目前，国内外还未见有用红色蛋白报告基因RUBY的作为可视化筛选标记基因，对保加利亚黄皮尖椒种子无菌苗子叶进行农杆菌转化，得到带有可见光下裸眼可见的表达产物呈红宝石色的报道。本研究通过带有RUBY基因的农杆菌转化对植物进行转化，可实现在植物转化后对阳性转化植物的形态学标记筛选，从而成为裸眼可视化筛选标记的转化方法。

发明内容

本研究提供了一种带有可见光下可视筛选标记的保加利亚黄皮尖椒遗传转化方法，利用报告基因系统RUBY的表达产物呈红宝石色这个特点，将它运用在没有该色素背景的保加利亚黄皮尖椒基因工程实验中。

本发明属于基因工程技术领域方面的研究，是在可见光下能用肉眼看到红色筛选标记的一种保加利亚尖椒遗传转化方法。其特征在于：解决了定量检测需要依赖于间接检测的问题，发明了一种带有可见光下裸眼可见的筛选标记保加利亚黄皮尖椒遗传转化方法。具体步骤如下：