[发明专利]一种带有可视化筛选标记的保加利亚黄皮尖椒遗传转化方法

权利要求书

1.一种可见光下带有肉眼可见的筛选标记的保加利亚黄皮尖椒遗传转化方法，其特征在于一种可见光下裸眼可视化筛选标记的保加利亚黄皮尖椒遗传。转化方法包括以下步骤：

(1)选取成熟的保加利亚黄皮尖椒种子，将辣椒种子用50℃温水恒温浸泡20min左右，用无菌水冲洗3～5次后用75％乙醇浸泡60s左右，接着用无菌水冲洗3～5次，再以NaClO浸泡4min左右，最后用无菌水冲洗6～7次，播种于不加激素的培养基上(蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基+B5100×，pH 5.8～6.0)，暗培养(24±2℃)至种子萌发，然后在24±2℃、光周期12h/d的条件下培养，得到无菌苗；

(2)取12d苗龄的无菌苗，切去子叶上半部分，将带柄子叶接种于愈伤诱导培养基(MS4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L+6-BA 1mg/L+IAA 0.1mg/L+Vc 100mg/L，pH 5.8-6.0)。暗培养一周，培养温度24±2℃。

(3)愈伤培养后，将愈伤组织置于浸染培养基(MS 4.74g/L+蔗糖30g/L),超声波震荡30s后加入带有红色蛋白报告基因RUBY的农杆菌，避光于28℃、200r的摇床中摇3h。

(4)将浸染后的愈伤组织转移到愈伤诱导培养基(MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L+6-BA 1mg/L+IAA 0.1mg/L+Vc100mg/L，pH 5.8-6.0)上24±2℃暗培养4-5天。

(5)将上述愈伤组织转移到不定芽分化培养基(MB+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L+6-BA5.0mg/L+IAA 0.5mg/L+ABA 0.3mg/L+Spm 100μmol/L+AgNO₃ 5.0mg/L+Vc 100mg/L，pH 5.8～6.0)上，24±2℃暗培养1d。然后转移到24±2℃、光照强度2000-2500lx条件下，光培养1周。

(6)经不定芽培养后，肉眼观察愈伤组织和发芽的叶片是否带有明显红色。然后将带明显红色的芽的愈伤组织转移到芽伸长培养基(MB+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L+Spm 100μmol/L+AgNO₃5.0mg/L+IAA 0.2mg/L+GA₃1.0mg/L+PBU 0.1mg/L+Vc 100mg/L，pH 5.8～6.0)上，在24±2℃、光照12h/d、光照强度2000～2500lx条件下，培养2-3周。

(7)将得到转化后的无菌苗转入生根培养基(MB+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L+IAA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+Vc 100mg/L，pH 5.8～6.0)上，在24±2℃、光照12h/d、光照强度2000～2500lx条件下，培养4周。

(8)将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗7d，揭开封瓶膜在练苗2d，移栽到灭菌的黄心土中生长，得到带有可见光下裸眼可见的红色蛋白报告基因RUBY的再生植株。