[发明专利]hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官及其制备方法

说明书

本发明涉及hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官及其制备方法，属于生物医学和发育生物技术领域。方法包括如下步骤：将hPSCs贴壁培养，增殖后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养分化，分化第1天，每天半换液进行培养，更换的培养液均为腹侧化因子SHH。分化第7天时进行贴壁培养，第10天时得到神经管样细胞结构。分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，将管底细胞用NIM培养液悬浮培养，其中添加SHH和B27，第17天将自发形成球状神经前体细胞。分化第25天使用含有β‑NGF的NIM培养，在分化第45天获得包含大量胆碱能神经元的基底前脑胆碱能类器官。本发明体外模拟了基底前脑的发育，为多种医学实验提供了细胞模型。

技术领域

本发明涉及一种hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官及其制备方法，属于生物医学和发育生物技术领域。

背景技术

基底核团对正常的脑功能和行为至关重要。其中，基底前脑胆碱能神经元参与记忆、情感和奖励学习等高级认知功能的调节，并在唐氏综合中呈现出不同程度的损害。基底前脑胆碱能神经元投射系统在学习认知中发挥关键作用。然而由于伦理要求，人脑组织样本尤其是胚胎时期的脑组织，更是难以获取。目前对唐氏综合征研究主要为小鼠等模式动物，但由于模式动物与人类大脑之间的种属差异，使得仅用动物模型来研究人类神经系统疾病的局限性不可避免。

人脑是一个复杂的器官，包含多种细胞和组织类型，它们通过错综复杂的途径相互作用。神经病理条件往往是这些细胞类型之间复杂相互作用的结果。虽然在2D培养中，人类诱导多能干细胞分化为神经元有助于我们理解神经退行性疾病相关的发病机制，但这些系统只能模拟单个大脑区域，而不能完全捕获不同细胞类型之间的复杂相互作用。最近开发了一些大脑球状体或类器官方案，以便更好地建模神经结构和功能的复杂性，并为细胞的发育和成熟提供更真实的3D环境。

近年来，从hPSCs分化出来的人脑类器官被认为是研究人脑发育/发病机制的有效实验模型。hPSCs可在体外通过诱导，自发组织成被称为类器官（organoid）的多细胞器官样结构。人脑类器官可以在很大程度上概括离散的大脑区域的结构功能特性，为人脑发育和神经系统疾病提供了可研究的模型基础。已有研究通过单细胞测序对比分析了人类大脑细胞、人脑类器官细胞和猕猴等灵长类动物大脑细胞，发现人脑类器官与人类大脑具有高度相似性，从而证明了人脑类器官可作为模型研究人类大脑发育及神经系统疾病。

目前已经建立了产生多种特定区域的类脑器官，例如脑皮质，丘脑，下丘脑，中脑和脊髓，这有助于研究神经系统疾病的发病机制，例如小头畸形，自闭症和阿尔茨海默氏病。然而，目前仍无产生基底前脑胆碱能类器官的方法报道。在神经系统发育过程中，基底前脑发育起源于内侧神经节隆起(Medial ganglionic eminence， MGE)。其中，MGE可大量表达转录因子NKX2.1、LHX6、LHX8等，产生大量胆碱能神经元，成熟的胆碱能神经元则会表达标记物CHAT、VACHT等。因此，建立一种高效诱导hPSCs定向分化为基底前脑胆碱能类器官的方法尤为重要。

发明内容

发明目的：针对上述现有存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官及其制备方法，找到了一种高效分化hPSCs至基底前脑胆碱能类器官的方法，体外模拟了基底前脑的发育过程，构建了神经疾病模型，为研究发病机制、分子机理、细胞筛药提供了细胞模型。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将hPSCs贴壁培养，增殖后消化制成拟胚体（embryonic body，EB），在神经诱导培养液中悬浮培养分化，此天记为第0天；

步骤2：分化第1天记为第1天，每天半换液进行培养，更换的培养液均为腹侧化因子SHH；

步骤3：分化第7天时进行贴壁培养，第10天时得到神经管样细胞结构；