[发明专利]hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官及其制备方法

权利要求书

1.一种hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1：将hPSCs贴壁培养，增殖后消化制成拟胚体（embryonic body，EB），在神经诱导培养液中悬浮培养分化，此天记为第0天；

步骤2：分化第1天记为第1天，每天半换液进行培养，更换的培养液均为腹侧化因子SHH；

步骤3：分化第7天时进行贴壁培养，第10天时得到神经管样细胞结构；

步骤4：分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，自然沉降，弃上清，将管底细胞用NIM培养液悬浮培养，其中添加体积比为1：50的SHH和B27，第17天将自发形成球状神经前体细胞；

步骤5：分化第25天使用含有β-NGF的NIM培养，在分化第45天获得包含大量胆碱能神经元的基底前脑胆碱能类器官。

2.根据权利要求1所述的hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官的制备方法，其特征在于：所述步骤1具体步骤为：将hPSCs贴壁培养于在4℃用基质胶Vitronectin提前一晚包被过的培养皿中，hPSCs在培养皿中增殖至60-80%密度时进行消化，置于37°C，5% CO₂的孵箱中孵育1~7分钟，显微镜下观察到克隆边缘发亮，并微微卷起时，将Dispase吸除，用DMEM/F12轻洗一遍细胞，再用DMEM/F12轻轻将克隆吹下，一边吹一边将已吹下的克隆从液体中吸出转移至15ml离心管中，将离心管离心，800rpm，1min后吸弃上清，将管底的细胞转移至细胞培养瓶中悬浮培养，换上神经诱导培养液（Neural induction medium，NIM），将细胞制成EB，此时为细胞分化的第0天。

3.根据权利要求2所述的hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官的制备方法，其特征在于：所述提前一晚包被过的培养皿中培养液为Essential 8，由体积比为50:1的Essential 8^TM Basal Medium DMEM/F12(Ham)（1:1）与Essential 8^TM Supplement（50X）配制而成；用1U/ml的Dispase进行消化，所述神经诱导培养液NIM为DMEM/F12培养基、NEAA和N2以体积比98:1:1配制而成。

4.根据权利要求1所述的hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官的制备方法，其特征在于：所述步骤2的腹侧化因子SHH浓度为250-1000ng/ml。

5.根据权利要求1所述的hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官的制备方法，其特征在于：所述步骤3具体步骤为：分化第7天时把EB从培养瓶吸出置于离心管中，待细胞自然沉降到管底后，吸走上清，用枪将拟胚体吸出，置于细胞培养皿中，每个培养皿中大约含40-50个EB，10小时后更换为加入SHH的神经诱导培养液。

6.根据权利要求1所述的hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官的制备方法，其特征在于：所述步骤3中所用的培养液为NIM和10%的 胎牛血清FBS混合液。

7.根据权利要求1所述的hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官的制备方法，其特征在于：所述步骤5所述的含有的β-NGF浓度为50ng/ml。

8.一种hPSCs诱导分化制备的基底前脑胆碱能类器官，其特征在于：其由权利要求1-7的所述的任一方法制得。